高邮鸭和金定鸭发育早期骨骼肌MyoG和Myf6基因的表达分析

【目的】研究生肌调节因子肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(Myf 6)基因表达对鸭胚胎期及初生早期骨骼肌发育的影响。【方法】采用Real-time PCR方法研究MyoG、Myf6基因在不同鸭品种(高邮鸭和金定鸭)胚胎期(13,17,21,25,27胚龄)及初生早期(出雏后7日龄)骨骼肌发育中的表达差异,并分析其表达变化与胸、腿肌发育的相关性。【结果】MyoG和Myf6基因在2个品种鸭胸肌、腿肌组织发育早期均有表达,但不同组织存在不同的表达模式。MyoG在鸭胚胸肌、腿肌组织中均呈现"前高后低"的表达模式,21胚龄以前表达量相对较高,随后表达量下降,并维持相对较低水平;而Myf6基因在胸肌组织中在21胚龄时表达量最高,随后表达量下降,但仍维持相对较高的表达水平;在腿肌组织中在13胚龄时表达量较高,在17胚龄时达到最高,随后表达量有所降低,并在21胚龄后急速下降至极低水平,但其表达在胚胎期后期(27胚龄)以及初生期(7日龄)又有缓慢上升趋势。二元变量相关性分析结果表明,2个品种鸭胸肌、腿肌MyoG mRNA表达与胸肌、腿肌发育呈强负相关;胸肌中Myf6mRNA的表达与胸肌发育无显著相关性,腿肌中Myf6mRNA的表达与腿肌发育呈强负相关。【结论】骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达具有显著的时空性,性别差异不显著,骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达与鸭发育早期骨骼肌质量变化呈现负的线性相关。     

不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞GHR和IGF 1 mRNA表达差异分析

为探讨生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）和胰岛素样生长因子 1（Insulin like growth factor 1,IGF 1）在不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达差异。选择生长速度不同的金定鸭和高邮鸭为试验动物,采用实时荧光定量PCR方法检测鸭13,15,17,19,21和23胚龄时胸肌和腿肌成肌细胞GHR,IGF 1 mRNA的表达情况,并进行了品种间比较。结果发现：13胚龄时,高邮鸭胸肌和腿肌成肌细胞IGF 1的表达均显著高于金定鸭（P<0.05）;17胚龄是两个品种鸭GHR和IGF 1共同的表达高峰期;17胚龄之后,鸭胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达均显著降低。在19,21胚龄时,高邮鸭胸肌成肌细胞2个基因的表达均显著高于金定鸭（P<0.05）,而腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达在品种间无显著差异（P>0.05）。鸭胚胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达呈现极显著的正线性相关（P<0.01）。提示：GHR和IGF 1的表达谱及各自在品种间的变化规律基本一致;鸭胚骨骼肌成肌细胞GHR和IGF 1 mRNA表达有组织特异性,二者之间可能存在正调控的作用机制。     

鸭胚胸肌成肌细胞IGF-Ⅰ和MSTN基因的表达分析

[目的]本文旨在探讨IGF-Ⅰ和MSTN基因在鸭胚胸肌成肌细胞的表达规律。[方法]以生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验对象,采用实时荧光定量PCR方法检测鸭13、15、17、19、21和23胚龄时胸肌成肌细胞IGF-Ⅰ、MSTN mRNA的表达情况,并进行品种间比较。[结果]IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达都呈先升后降的趋势,都存在17胚龄的表达高峰,19胚龄之后,表达显著下调并持续至23胚龄;高邮鸭IGF-ⅠmRNA的表达比金定鸭多了13胚龄的表达高峰,且在13胚龄时,2个基因的表达量都是高邮鸭极显著高于金定鸭(P0.01)。与之相反,IGF-Ⅰ/MSTN mRNA表达量的比值都是呈先降后升的趋势,在19胚龄之前比值小于1,21胚龄至23胚龄时,表达量比值显著升高;品种间是高邮鸭的显著高于金定鸭(P0.05)。IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达均无显著品种效应,而IGF-Ⅰ/MSTN mRNA表达量比值品种效应显著。2个品种的IGF-Ⅰ与MSTN mRNA表达均呈极显著正相关。[结论]IGF-Ⅰ与MSTN协同调节成肌细胞的增殖与分化,二者表达量比值在品种上的差异可能是造成鸭胚胸肌发育品种差异的重要因素。     

鸭胚胎发育中后期胸肌发育阻滞的RNA-seq分析

【目的】选择两个中国地方品种高邮鸭和金定鸭,对鸭胚胎发育中后期胸肌进行转录组分析研究,旨在探明胸肌发育阻滞的分子变化机制,为鸭骨骼肌调控机理研究打下基础。【方法】在21胚龄和27胚龄两个时间点,分别解剖高邮鸭、金定鸭各3只,采集胸大肌,提取总RNA构建文库,利用Illumina的HiseqTM2000进行高通量测序,并利用生物信息学方法进行差异表达基因挖掘、基因功能注释等分析,探讨21胚龄和27胚龄两个时间点之间胸肌发育阻滞的分子机制。【结果】高邮鸭、金定鸭21胚龄和27胚龄胸大肌组织RNA-seq质量Q20均在94%以上,Q30均在89%以上,测序得到的结果可靠,可用于后续分析。RNA水平相关性检查和基因mRNA表达量聚类图结果都表明,21胚龄(27胚龄)高邮鸭和金定鸭之间表达模式的相关性高于高邮鸭(金定鸭)21胚龄和27胚龄之间的表达模式。不同品种内时间点之间的差异基因数量(高邮鸭6 128个,金定鸭6 452个)远多于同一时间点不同品种间的差异基因数量(21胚龄522个,27胚龄299个)。qRT-PCR验证试验结果与RNA-seq分析结果相关性较强。通过GO和KEGG富集分析发现,高邮鸭、金定鸭胸肌在21胚龄到27胚龄阶段,能量代谢相关基因(主要为辅酶Q相关基因、ATP酶合成相关基因和细胞色素C相关基因)均显著上调,DNA复制和细胞周期相关基因(主要为微型染色体维持蛋白(MCM)相关基因、复制因子C(RFC)相关基因)均显著下调。相关基因表达的变化可能与此阶段成肌细胞增殖速度减慢,逐渐退出细胞周期开始准备下一阶段融合成多核肌管并形成肌纤维有关。对肌肉生长发育相关的关键基因分析发现,促进肌肉生长的IGF1和诱导成肌细胞末端分化的MyoG显著下调,促进肌纤维分化融合的MUSTN1基因、诱导肌祖细胞向成肌细胞转化的MyoD1基因显著上调。【结论】鸭胚胎中后期胸肌发育过程中大量基因差异表达。其中能量代谢相关基因的上调和DNA复制、细胞周期相关基因的下调,以及肌肉发育相关基因MUSTN1显著上调,IGF1、MyoG等显著下调,可能与鸭胚胎中后期胸肌发育阻滞现象密切相关。     

不同鸭种胚胎期和岀雏早期肌肉组织中IGF-Ⅰ基因mRNA的差异表达分析

【目的】研究不同品种鸭胚胎期和出雏早期胸肌、腿肌中IGF-Ⅰ基因mRNA表达水平的发育性变化。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,研究生长速度不同的"高邮鸭"和"金定鸭"13,17,21,25,27胚龄和出雏后7日龄胸肌、腿肌中IGF-Ⅰ基因mRNA的表达规律。【结果】IGF-ⅠmRNA的表达规律在2个品种鸭的早期肌肉发育过程中较为一致,胸肌和腿肌IGF-ⅠmRNA表达量都是在13胚龄时最高,公鸭和母鸭同一肌肉组织IGF-ⅠmR-NA表达没有显著差异(P>0.05);不同品种间,IGF-ⅠmRNA在"高邮鸭"胸肌中的表达量除27胚龄外,其他发育时期均高于"金定鸭",且在13和21胚龄及7日龄时呈显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01),而"高邮鸭"腿肌IGF-ⅠmRNA的表达量在不同发育时期均高于"金定鸭",但差异不显著(P>0.05);同一品种内IGF-ⅠmRNA在胸肌中的表达量高于腿肌,且除13胚龄外,其他发育时期都显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于其在腿肌中的表达量。【结论】鸭肌肉中IGF-Ⅰ基因mRNA表达水平具有显著的年龄依赖性和明显的品种特征及组织差异,肌肉中IGF-Ⅰ基因mRNA表达对鸭早期生长发育有重要影响,且对胸肌生长发育的启动要早于腿肌。     

鸭发育早期胸肌和腿肌NFAT5 mRNA差异表达及其与生长发育的相关性

为了研究不同鸭种胚胎期和出雏早期骨骼肌(胸肌和腿肌)NFAT5基因mRNA表达规律及其与生长发育的相关性,本试验克隆了鸭NFAT5基因cDNA部分片段,并运用荧光绝对定量PCR技术检测了生长速度差异较大的高邮鸭和金定鸭13、17、21、25和27胚龄及7日龄胸肌和腿肌中NFAT5 mRNA的表达水平。结果显示,胸肌和腿肌NFAT5 mRNA在2种鸭中均具有相似的表达模式,均在13胚龄时表达量达最高,且均显著高于其他各胚龄和7日龄(P0.05),而出雏后7日龄的表达水平显著高于27胚龄(P0.05)。相关性分析结果显示,2种鸭胸肌和腿肌NFAT5 mRNA表达量与其胸肌质量、腿肌质量和体质量均呈极显著负相关(P0.01),而与组织中IGF-I mRNA的表达量呈极显著正相关(P0.01)。表明鸭胸肌和腿肌NFAT5与IGF-I存在协同效应,两者可能共同参与了对骨骼肌生长发育的调节。     

外源T3对鸭胚骨骼肌发育和MyoD mRNA表达的影响

甲状腺激素(thyroid hormones,THs)是体内肌肉发育的重要调节因子,MyoD在骨骼肌特异基因的转录调控,肌细胞的定向和分化中起着主要作用。为探讨三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)对鸭胚骨骼肌生长发育和Myod mRNA表达的影响,分别注射100μL含0.25μg(注射组)和0μg(对照组)T3的生理盐水溶液到入孵前的鸭种蛋蛋清内,检测鸭胚骨骼肌发育和MyoD mRNA的表达情况。结果表明,外源T3对鸭胚胸肌率、腿肌重和腿肌率的影响不显著(P0.05),但显著提高27胚龄鸭胚的体重和胸肌重(P0.05);胸肌MyoD mRNA表达与胸肌重的变化趋势相一致,其中27胚龄注射组胸肌的表达水平显著高于对照组(P0.05);注射组腿肌MyoD mRNA表达在13胚龄显著提高(P0.05),与腿肌发育早于胸肌相一致;注射组胸肌MyoD mRNA表达与胸肌重呈显著正线性相关,胸肌率呈负相关,腿肌MyoD mRNA与腿肌重呈负线性相关。结果显示,外源T3提高了出雏前鸭胚的体重和胸肌重,可能是通过调节MyoD mRNA表达参与胸肌的生长发育。     

鸭胚骨骼肌GHR基因表达与生长发育的关系

为了研究不同品种鸭胚胎期胸肌和腿肌中GHR基因mRNA的发育变化规律,采用实时荧光定量PCR方法测定生长速度不同的高邮鸭和金定鸭在13日、17日、21日、25日和27日胚龄时胸肌和腿肌中GHR基因mRNA的表达水平,并分析其与胚重、胸肌重和腿肌重的关系。结果表明:GHR mRNA在两个品种鸭肌肉早期发育中表现出一致的表达规律,在胸肌中呈"波浪形",在腿肌中呈先降后升再降,然后趋于水平的表达趋势。胸肌和腿肌GHR mRNA的表达量在两个品种相同胚龄间差异均不显著(P>0.05)。不同性别间比较,除了在27日胚龄时,公鸭胸肌GHR mRNA略低于母鸭外,其他胚龄都是公鸭高于母鸭。在13日、17日和21日胚龄时,两个品种鸭的胸肌GHR mRNA的表达量均显著或极显著低于腿肌(P<0.05或P<0.01),而在25日和27日胚龄时,两个品种鸭的胸肌GHR mRNA的表达量均极显著高于腿肌(P<0.01)。相关性分析表明,两个品种鸭胸肌中GHR mRNA的表达与其胸肌重和胚重均呈极显著正相关(P<0.01);两个品种鸭腿肌中GHR mRNA的表达与其腿肌重和胚重均呈极显著负相关(P<0.01)。提示,肌肉中GHR基因表达具有显著的胚龄、组织和性别差异,但不存在品种差异;在鸭胚胎期,胸肌中GHR mRNA表达对胸肌重和胚重可能有正调控作用,而腿肌中GHR mRNA表达对腿肌重和胚重可能有负调控作用。     

IGF-I-CaN-NFATc3信号通路相关基因在鸭发育早期骨骼肌中的同步表达及其与肌纤维性状相关性

【目的】IGF-I-钙调磷酸酶（CaN）-NFAT信号途径是调节肌肉生长、决定不同肌纤维类型的主要信号途径,本研究选择生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验材料,首次对不同品种鸭胚胎期和出雏早期肌肉中IGF-I-CaN-NFAT信号通路相关基因的表达规律及其与肌纤维类型的相关性进行了研究。【方法】采用实时荧光定量PCR方法研究鸭13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄胰岛素样生长因子( insulin-like growth factors, IGF-I) , 钙调磷酸酶（calcineurin, CnAα）和活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT c3）基因的表达量,同时采用肌球蛋白ATPase碱孵育法对两个鸭种腓肠肌外侧头不同发育阶段的肌纤维性状进行组织学观察,对不同类型肌纤维比例进行统计,用SPSS20.0软件进行差异显著性分析,探讨IGF-I-CaN-NFAT信号通路相关基因对鸭骨骼肌肌纤维类型转换的调控机制。【结果】随着胚龄或日龄增加,两鸭种快肌纤维比例均呈现下降趋势,中间型肌纤维比例仅存在少量波动,慢肌纤维比例除在高邮鸭中27胚龄时有所下降外,总体上呈现上升的趋势;IGF-I, CnAα和 NFATc3 基因在不同鸭种的同一肌肉部位的表达模式相对一致,仅存在显著的发育时段差异,在不同的部位（胸肌和腿肌）的表达也存在差异,但并不存在显著的性别效应,3个基因均在13胚龄即可检测到表达,且表达量均表现为最高,显著地高于其他各胚龄的表达量,提示IGF-I-CaN-NFATc3信号通路可能在鸭胚胎发育早期肌纤维的形成过程中发挥了重要作用。CnAα mRNA在胸肌中呈近似“V”形的表达趋势,21胚龄时表达量最低然后呈持续上升趋势,而在腿肌中则呈“波浪形”表达趋势,表达量最低点出现在27胚龄;NFATc3在胸肌和腿肌中的表达量均表现为13胚龄最高,然后至17胚龄显著下降并维持在较低的表达水平,在胸肌中表达量最低点出现在21胚龄,而腿肌中21胚龄的表达量则要显著高于17、25、27胚龄和7日龄的表达量,17胚龄表达量最低;IGF-I mRNA在胸肌和腿肌中总体上表现为先下降,至出雏前（27胚龄）降至最低,然后出雏后一周略有上升的趋势。IGF-I, CnAα和 NFATc3 基因的表达两两之间均表现出显著或极显著的正相关关系,同时,3个基因的表达与快肌纤维比例存在正相关,而与慢肌纤维比例及中间型纤维的比例呈负相关。【结论】在鸭胚胎发育后期至出雏早期,腓肠肌外侧头肌纤维类型存在由快肌纤维向慢肌纤维转换的趋势,IGF-I-CaN-NFAT信号通路相关基因之间存在协同表达,在鸭早期骨骼肌纤维类型转换中可能发挥着调控作用。     

不同鸭种肌肉发育早期TRα基因的表达及其与部分生长性状的相关分析

为探讨不同鸭种胚胎期和初生早期胸肌和腿肌中甲状腺激素受体(TRα)基因表达水平的发育性变化及其对胸肌质量、腿肌质量和胚质量(或体质量)的影响,选用生长速度差异较大的高邮鸭和金定鸭为研究材料,采用实时荧光定量PCR方法检测两鸭种13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄时胸肌和腿肌中TRαmRNA的表达水平。结果表明:在鸭胚胎期和初生早期,两鸭种肌肉TRαmRNA的表达趋势较为一致,即在胸肌中呈"W"形,在腿肌中呈前高后低的表达规律。在13、17和21胚龄时两鸭种胸肌TRαmRNA的表达量均极显著低于腿肌(P0.01),而在25、27胚龄和7日龄时则均高于腿肌。相关性分析表明:两鸭种胸肌中TRαmRNA的表达量与其胸肌质量、胚质量(或体质量)均呈极显著正相关(P0.01),腿肌中TRαmRNA的表达量与其腿肌质量、胚质量(或体质量)均呈极显著负相关(P0.01)。提示:肌肉中TRα基因表达具有显著的年龄依赖性和组织特异性,但不存在品种差异;TRα可能对鸭肌肉的生长发育具有一定的作用。     

鸭出雏前后腿肌IGF-1基因表达规律研究

 为探讨家鸭出雏前后腿肌类胰岛素样生长因子（IGF-1）的表达规律,本研究采用荧光定量PCR和原位杂交（ISH）技术,选取高邮鸭和金定鸭13,17,21,25,27日胚龄和7日龄共192个腿肌样本为研究对象。首次发现IGF-1 mRNA在两个品种不同胚龄和日龄腿肌中的表达量规律：两个品种鸭腿肌IGF-1 mRNA表达量差异不显著（P>0.05）;腿肌13日胚龄表达量极显著高于其他时间点（P<0.01）,并随着胚龄的增加逐渐降低。同时,原位杂交结果显示,血管周围及腿肌肌肉肌束间的肌膜中IGF-1 mRNA的表达量明显高于周边腿肌肌肉组织。研究结果表明,IGF-1基因对鸭胚胎期腿肌的生长发育具有重要意义。     

关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响

【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1,Myf5,MyoG和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中, MyoD基因家族会被抑制。该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达情况,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1（+）和pGL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析 MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD后,pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200 ng时增强作用最强,差异显著(P＜0.05);转染pcDNA3.1（+）-MyoG后,虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P＞0.05);而转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG后,pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显 (P＞0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05);而外源过表达转录因子 MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

5-bromo-2'-deoxyuridine blocks myogenesis by extinguishing expression of MyoD1

The pyrimidine analog 5-bromodeoxyuridine (BUdR) competes with thymidine for incorporation into DNA. Substitution of BUdR for thymidine does not significantly affect cell viability but does block cell differentiation in many different lineages. BUdR substitution in a mouse myoblast line blocked myogenic differentiation and extinguished the expression of the myogenic determination gene MyoD1. Forced expression of MyoD1 from a transfected expression vector in a BUdR-substituted myoblast overcame the block to differentiation imposed by BUdR. Activation of BUdR-substituted muscle structural genes and apparently normal differentiation were observed in transfected myoblasts. This shows that BUdR blocks myogenesis at the level of a myogenic regulatory gene, possibly MyoD1, not by directly inhibiting the activation of muscle structural genes. It is consistent with the idea that BUdR selectively blocks a class of regulatory genes, each member of which is important for the development of a different cell lineage.     

鸭发育早期骨骼肌异步发育和IGF-I/MSTN-A mRNA表达的相关性

【目的】选择生长速度不同的高邮鸭和金定鸭为试验模型,比较2个不同品种鸭胚胎期和出雏早期骨骼肌中胰岛素样生长因子I（insulin-like growth factor I,IGF-I）、肌肉生长抑素A（myostatin A,MSTN-A）mRNA的表达规律及其与胸浅肌和腓肠肌（简称为胸腿肌）发育模式的相关性。【方法】在鸭13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄时,记录体重、胸浅肌（PM）和腓肠肌外侧头（LM）的重量,采用实时荧光定量PCR方法研究骨骼肌中IGF-I和MSTN mRNA的表达规律。【结果】本试验证明鸭早期发育过程中,体重和骨骼肌重的变化呈现极显著的品种和时间特异性;鸭胚胎期胸/腿肌的IGF-I和MSTN-A mRNA的表达与体重、胸/腿肌重均呈极显著的负相关,各自与胸/腿体指数则呈反式的相关性（正/负）,均在13胚龄有一个表达高峰,IGF-I和MSTN-A mRNA表达之间存在极显著的正相关;鸭PM中IGF-I mRNA表达转折点的出现时间与胸肌绝对生长和相对生长变化趋势是吻合的,而LM中IGF-I mRNA的表达与腿肌生长和肌纤维特性变化均不相符;鸭胚胎期MSTN-A mRNA的表达趋势与骨骼肌生长和肌纤维数量形成高峰同步;胸腿肌中IGF-I/MSTN-A mRNA表达比值的变化趋势和肌纤维特性变化吻合,PM中的IGF-I/MSTN-A mRNA表达比值的差异点和PM重量出现品种差异的时间点一致。【结论】在胚胎发育中后期和出雏后早期,鸭的胸腿肌呈现异步发育模式,骨骼肌中IGF-I和MSTN mRNA表达的相对水平参与骨骼肌生长速率的调节。     

The SNPs Analysis of the Exons of Three Genes of MyoD Gene Family in Seven Swine Breeds (Line)

The study objects includes seven swine breeds: Minzhu, Sanjiangbaizhu, Yorkshire, Landrace, Junmuyihao, Duroc and Double muscle Yorkshire. According to the sequences of MyoG, MyoD and Myf5 of swine in GenBank, seventeen pairs of primers for MyoG, MyoD and Myf5 were designed. PCR-SSCP technology was applied to detect SNPs of the exons of the three genes. The results showed that no polymorphism was in MyoG and MyoD, and some SNPs were in three exons of Myf5. There was one mutant site in the first exon of Myf5 (G → C), three mutant sites in the second exon of Myf5 (C → A, A → G and G → A); in the third exon of Myf5, there was one base A deficiency at 3 387 bp, three bases T deficiency at 3 417 bp, one mutant site at 3 443 bp (T → C).This study obtained a tendency conclusion that gene frequency of allele M of Myf5 on the one hand is positively correlated with lean meat percentage, on the other hand is correlated with the orientation of selective breeding; it also deduced that allele F is possibly correlated with high lean meat percentage. Through statistical analysis, allele A, B, C of Myf5 have no obvious correlation with lean meat percentage of different swine breeds, In addition, the high polymorphism of Myf5 showed that seven swine breeds are rich in genetic variation, and have high selective competency.     

Culture and Identification of Myoblasts Isolated from Duck Embryos

Using embryonic myoblasts to research the formation and de-velopmental mechanisms of skeletal muscle is becoming a research hotspot. This study aimed to establish a method of isolation, culture and identification of my-oblasts in duck embryos. [Method] Pectoral and leg muscle samples were isolated from the embryos of Gaoyou duck at 13 d of hatching, then disassociated with col-lagenase and trypsin and purified via differential adhesion. The isolated cells were cultured in vitro and detected for the expression of Pax7 protein using immunofluo-rescence technique. [Result] Myoblasts were obtained successful y both from pectoral and leg muscles in duck embryos and these cells proliferated strongly and differen-tiated wel . Immunofluorescence staining showed that more than 95% cells could express Pax7 protein. [Conclusion] In summary, we report the successful establish-ment of a complete system for the isolation, purification, identification and culture of myoblasts from duck embryos.     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。