PrPc重组蛋白脑内接种金黄地鼠对mRNA表达的影响

为明确将牛PrPc重组蛋白接种金黄地鼠脑内是否引起异常临床表现、脑组织病理学变化及对其mRNA表达产生影响,为进一步研究PrPc蛋白与异构体PrPsc 的结构转换机制提供基础数据,将纯化的牛PrPc重组蛋白磷酸盐缓冲液制剂进行地鼠颅内接种,约3 μL/只,对照接种磷酸盐缓冲液（PBS）;102 d后取出脑组织：一部分福尔马林固定后进行常规H.E.染色观察, 另一部分提取脑组织总RNA,进行实时荧光定量RT-PCR检测.结果表明：处理未见临床异常表现;大脑、小脑、脑干组织病理学检测未见海绵状空泡变性和淀粉样斑;大脑PrPc mRNA表达水平无显著性差异.上述结果表明,用PrPc重组蛋白接种,在检测时间102 d内未引起金黄地鼠行为和脑组织的异常改变.     

中国黄牛背最长肌中capn1 mRNA表达与嫩度的关系

采用实时荧光定量PCR方法研究了中国黄牛背最长肌中capn1 mRNA表达与嫩度的关系.结果表明,capn1 mRNA表达量与宰后第3天的牛肉嫩度高度相关(r=0.855).酪蛋白底物酶原分析表明,不同肌肉的μ-calpain潜在酶活性存在很大差异,而m-calpain潜在酶活性差异不大.capn1 mRNA的表达可能是影响牛肉嫩度的主要因素.     

中国黄牛背最长肌中capnl mRNA表达与嫩度的关系

采用实时荧光定量PCR方法研究了中国黄牛背最长肌中capnl mRNA表达与嫩度的关系。结果表明，capnl mRNA表达量与宰后第3天的牛肉嫩度高度相关（r=0．855）。酪蛋白底物酶原分析表明，不同肌肉的μ-calpain潜在酶活性存在很大差异，而m-calpain潜在酶活性差异不大。capnl mRNA的表达可能是影响牛肉嫩度的主要因素。     

Ghrelin对奶山羊下丘脑神经肽Y(NPY)和刺鼠相关蛋白(AGRP)mRNA表达的影响

研究Ghrelin对奶山羊下丘脑神经肽Y(NPY)和刺鼠相关蛋白(AGRP)mRNA表达的影响。10只泌乳期莎能奶山羊随机分为试验组和对照组,每组5只。试验组静脉注射Ghrelin(3.0μg/kg),3h后宰杀,迅速取下丘脑,检测下丘脑脑神经肽Y和刺鼠相关蛋白mRNA的表达。结果表明,一定剂量的Ghrelin对NPY mRNA的表达具极显著上调作用(P0.01);对AGRP mRNA的表达也有显著促进作用(P0.01)。以上结果提示Ghrelin可能通过对这些神经肽的作用参与对奶山羊摄食和能量代谢等生理活动的调节。     

正常孕妇与妊高症患者胎盘中Ghrelin、GHS-R mRNA的表达研究

[目的]通过比较正常孕妇与妊高症患者胎盘中Ghrelin及其受体GHS-RmRNA水平的变化,探讨Ghrelin及其受体与妊高症的发病是否相关。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了正常孕妇胎盘和妊高症患者胎盘中Ghrelin及其受体GHS-RmRNA水平相对表达量的变化。[结果]正常孕妇胎盘组织中mRNA水平与妊高症患者胎盘组织中mRNA水平无显著性差异,但Ghrelin受体GHS-R在两者之间的mRNA水平有显著性差异（P〈0．05）。[结论]Ghrelin及其受体在妊高症患者和正常孕妇胎盘中表达的相对变化表明,Ghrelin受体缺乏可能成为妊高症发病的因素之一。     

交配和黑光灯处理对棉铃虫Helicoverpa armigera生物钟基因cryptochromes mRNA表达的影响

[目的]明确交配和黑光灯处理对棉铃虫生物钟基因cryptochromes mRNA表达的影响。[方法]应用实时定量PCR（SYBR Green）技术检测不同条件下棉铃虫cryptochromes（cry1和cry2）基因的表达。提取棉铃虫头部总RNA,经DNase I消化后进行反转录合成cDNA,并采用特异性引物分别对cry1、cry2和EF-1α基因进行实时定量PCR扩增。[结果]黑光灯处理棉铃虫2h,其cry1mRNA的表达量明显降低;cry2mRNA的表达量小于对照,但两者之间差异性并不显著。交配对棉铃虫cry1和cry2mRNA表达均存在显著影响,并且雌、雄两性cry1和cry2mRNA表达量在交配后随时间延长呈下降趋势。[结论]该结果对进一步研究cry基因的功能以及棉铃虫防治具有重要意义。     

外源性皮质醇对异育银鲫TSH-β mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响

运用Sybr Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法和放射免疫方法（RIA）分析了外源性皮质醇（cortisol）对异育银鲫促甲状腺激素β亚基（TSH-β）mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响.实验设计为10周,实验组每两周注射一次0.2 mg/kg体重的cortisol（用57%酒精溶解）,对照组注射同剂量的57%酒精.实验期间没有投喂饲料.在本实验条件下,研究结果显示：注射3次外源性cortisol后,异育银鲫TSH-β mRNA表达量与对照组相比略有下降;注射5次后,与对照组相比显著降低（P＜0.05）.另一方面,RIA结果显示：注射3次外源性cortisol后,实验组与对照组相比,血清甲状腺激素T3和T4含量虽略有升高,但无显著差异;而注射5次后显著升高（P＜0.05）.以上结果提示：外源性cortisol能够影响异育银鲫脑下垂体-甲状腺轴.     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1 (ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1mRNA表达在4、12、24、48、72h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。     

日龄对仔猪股骨骨髓组织抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响

为探明日龄对仔猪非特异性免疫形成的影响,分别于仔猪出生当天,3,14,23,28 d,随机屠宰杜长大仔公猪4头,采集股骨骨髓组织.用一优化的RT-PCR方法,以18S rRNA作内标,半定量分析不同日龄仔猪骨髓组织抗菌肽PR-39 mRNA表达的差异.结果表明:不同日龄间仔猪骨髓组织PR-39 mRNA相对表达量存在明显的差异.出生时最低,吮吸初乳2 d后显著增加,14日龄时较3日龄显著下降,随后随日龄的增加,其表达量呈上升趋势.     

低温胁迫对甘薯s-腺苷甲硫氨酸合成酶mRNA表达水平的影响

[目的]为研究s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在冷胁迫条件下的表达情况。[方法]分别提取4℃胁迫处理0、12、24、48和72 h后的甘薯叶、茎和块根组织总RNA,通过反转录和实时定量PCR技术分析了该基因的mRNA表达情况。[结果]叶、茎和块根组织中该基因表达量都明显升高,分别于胁迫后24、72和72 h达到表达高峰,其中块根组织表达量增加量最大。[结论]低温胁迫能够促进相关基因的mRNA表达水平升高。     

外源性皮质醇对异育银鲫TSH-β mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响

运用Sybr Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法和放射免疫方法（RIA）分析了外源性皮质醇（cortisol）对异育银鲫促甲状腺激素β亚基（TSH-β）mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响.实验设计为10周,实验组每两周注射一次0.2 mg/kg体重的cortisol（用57%酒精溶解）,对照组注射同剂量的57%酒精.实验期间没有投喂饲料.在本实验条件下,研究结果显示：注射3次外源性cortisol后,异育银鲫TSH-β mRNA表达量与对照组相比略有下降;注射5次后,与对照组相比显著降低（P＜0.05）.另一方面,RIA结果显示：注射3次外源性cortisol后,实验组与对照组相比,血清甲状腺激素T3和T4含量虽略有升高,但无显著差异;而注射5次后显著升高（P＜0.05）.以上结果提示：外源性cortisol能够影响异育银鲫脑下垂体-甲状腺轴.     

SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响

【目的】为了探索秦川牛（Bos taurus）SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1（NM_001077107.2）已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列siSMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-bSMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列siSMAD1和过表达腺病毒AD-bSMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%（诱导1d,P<0.01）、66.7%（诱导3d,P<0.01）、60.0%（诱导6d,P<0.01）、54.7%（诱导9d,P<0.01）。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10 ¹⁰pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-bSMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-bSMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍（诱导1d）、3.19倍（诱导3d）、105.3倍（诱导3d）,P<0.01）和144倍（诱导9d,P<0.01）;结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。 【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列siSMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。     

苦荞FtCAD-1和FtCAD-2基因克隆及组织表达分析

【目的】克隆苦荞肉桂醇脱氢酶（CAD）基因并分析其组织表达特性,为深入研究CAD基因在苦荞果壳形成中的分子调控机制提供理论依据。【方法】基于苦荞转录组测序结果,从苦荞厚果壳品种云荞1号和薄果壳品种小米荞克隆CAD基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CAD基因在不同果壳厚度类型（厚果壳苦荞和薄果壳苦荞）不同组织的表达情况。【结果】从薄果壳苦荞和厚果壳苦荞中均克隆获得2条苦荞CAD基因,且这2条基因序列在薄果壳苦荞与厚果壳苦荞中均完全一致,命名为FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的开放阅读框（ORF）长度为876bp,编码291个氨基酸残基,为疏水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质;FtCAD-2基因的ORF长度为1083bp,编码360个氨基酸残基,为亲水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞质。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3个典型的保守结构域,且不具有跨膜结构域和信号肽,属于非分泌蛋白。FtCAD-1与数据库目标蛋白2cf5.1.B的结构相似度为74.74%,而FtCAD-2与数据库目标蛋白5z0c.1.A的结构相似度为63.03%。FtCAD-1与拟南芥的第一类CAD蛋白（AtCAD4和AtCAD5）的亲缘关系较近;FtCAD-2与拟南芥的第二类CAD蛋白（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等）的亲缘关系较近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在种仁中的相对表达量最高,且厚果壳苦荞与薄果壳苦荞间无显著差异（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果壳苦荞叶、花和果壳中的相对表达量显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01）高于薄果壳苦荞,尤其是在厚果壳苦荞果壳中相对表达量是薄果壳苦荞的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果壳苦荞果壳中相对表达量显著高于厚果壳苦荞外,在其他组织中的相对表达量均表现为厚果壳苦荞高于薄果壳苦荞。【结论】FtCAD-1属于第一类CAD基因,具有明显的组织表达特异性,推测其在苦荞木质素生物合成过程中发挥重要调控作用。     

小菜蛾储存蛋白基因的克隆与表达分析

克隆和分析了2个小菜蛾的储存蛋白基因——Px AJSP-1和Px BJHSP-2.其中,Px AJSP-1属于芳基贮存蛋白,而Px BJHSP-2属于富甲硫氨酸储存蛋白.进化树分析表明,它们在同一目昆虫中相对保守.利用实时荧光定量PCR分析其表达模式,发现Px AJSP-1和Px BJHSP-2在4龄幼虫和蛹期高表达,且在脂肪体中的表达量远高于其他组织.     

铜对Ctr1基因mRNA表达的影响

采用半定量RT-PCR法检测铜对猪传代肾细胞（PK15）中特异性铜转运蛋白Ctr1基因mRNA表达水平的影响,以β-actin为内参考,对各试验组cDNA同时进行PCR扩增。结果,猪肾PK15细胞/%1基因mRNA表达量在7.8～31.2μmoL.L-1 Cu范围内随铜添加浓度的升高减少,当铜添加浓度达到62.5μmoL.L-1时,其表达量又有所回升,呈双相反应。     

不同药物对动脉粥样硬化兔体内两种受体表达的影响

为了给药物的筛选和利用提供基础数据,用手术法切除新西兰雌兔双侧卵巢,用高胆固醇饮食法制备动脉粥样硬化模型。利用实时荧光定量RT-PCR方法,对动脉粥样硬化兔心脏和肝脏内ER mRNA和LDLRmRNA的表达进行了分析。研究表明,ERα在模型组(C)、假手术组(SC)、正常饲料组(N)、利维爱组(TIB)、倍美力组(PRE)和新伐他汀组(SIM)心脏内的相对表达量分别为0.29、0.53、0.46、0.85、0.48、0.30,在肝脏内的相对表达量分别为0.32、0.51、0.49、0.68、0.50、0.30;低密度脂蛋白受体(LDLR)在模型组(C)、假手术组(SC)、正常饲料组(N)、利维爱组(TIB)、倍美力组(PRE)和新伐他汀组(SIM)心脏内的相对表达量分别为0.22、0.24、0.33、0.27、0.31、0.23,在肝脏内的表达量分别为0.86、0.93、1.52、1.27、1.19、0.88。结果显示,利维爱通过增加心脏和肝脏内雌激素受体、低密度脂蛋白受体的表达发挥抗动脉粥样硬化的作用。新伐他汀可以有效的防治动脉粥样硬化的发展,对心脏和肝脏内的2种受体的表达没有影响。倍美力防治AS的效果不明显,可以促进ERα和LDLR在心脏和肝脏内的表达。     

氟化钠对小鼠成骨细胞中RANKL/OPG mRNA体外表达的影响

为探讨氟化钠对小鼠成骨细胞中核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）mRNA表达比率的影响,选取新生小鼠颅盖骨,用胰蛋白酶-胶原酶消化法分离培养成骨细胞。取其第3代成骨细胞,在实验组培养液中加入不同浓度的氟化钠（10^-7、10^-6和10^-5mol/L）,并分别培养24、48、96和144 h,从细胞板贴壁细胞中提取总RNA,应用荧光定量RT-PCR方法检测细胞中RANKL与OPG mRNA表达比率的变化。结果显示,氟化钠增加了RANKL/OPG mRNA的表达比率,且呈明显的时间剂量效应关系。对照组和实验组在培养48 h时,RANKL与OPGmRNA的表达比率显著增加（P〈0.01）。本实验浓度的氟化钠能够增加小鼠颅盖骨成骨细胞中RANKL/OPG mRNA的表达比率。     

不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。     

家蚕类p23蛋白基因的表达分析

p23蛋白发现于Hsp90分子伴侣复合体中,在真核生物中广泛存在且高度保守。家蚕中的同源蛋白命名为类p23蛋白。逆转录PCR显示类p23蛋白基因Bm-p23-like在家蚕5龄第6 d幼虫的卵巢、睾丸等8个组织中有表达,但拷贝数有较大差异,可能与组织的活跃程度有关。利用实时定量PCR技术对Bm-p23-like及hsp90在家蚕温度胁迫条件下的表达进行定量分析,结果显示：在高温条件下,该基因与hsp90表达较对照组均有增加,二者比值是42.23（非胁迫对照组是25.10）;在低温条件下,该基因的拷贝数是对照的19.90倍,而hsp90是对照的0.60倍,二者比值仅为0.89。因此,我们推测在温度胁迫条件下家蚕类p23蛋白具有独立于Hsp90的功能。     

饲粮水平对猪IMF含量、脂肪酸合成酶mRNA表达量及血液激素含量的影响

试验选用84头10 kg左右杜洛克×长白×大约克(DLY)三元杂交阉公猪,随机分成2组,组内设6个重复,每个重复7头猪,研究了在NRC(1998)标准(对照组)、荣昌猪(GB 7223-1987)饲养标准(试验组)2种饲粮条件下营养水平对DLY猪生长肥育期背最长肌I MF含量、HSL及FAS mRNA表达量和血液激素含量的影响。结果表明:降低饲粮营养水平可降低35、80及110 kg DLY猪血清胰岛素含量和35及80 kg猪生长激素含量;同时可升高20、50及110 kg DLY猪血清肾上腺素含量和35、50及110 kg DLY猪胰高血糖素含量。各阶段试验组背最长肌肌内脂肪含量均高于对照组,DLY猪50 kg时达到了显著水平;除50 kg组外,其余各阶段试验组背最长肌HSL mRNA及FAS mRNA表达量均高于对照组;降低饲粮营养水平有升高20、35及80 kg DLY猪FAS mRNA/HSL mRNA的趋势。