猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体P36(L-乳酸脱氢酶)全基因序列,设计合成了2对引物,建立套式PCR方法。运用该方法对猪肺炎支原体不同菌株培养物进行了扩增,并对经肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后支气管肺泡灌洗液进行了检测。结果表明,不同菌种均能扩增出427 bp的目的条带,而其他病原菌未出现特异性扩增条带。建立的套式PCR方法检测猪肺炎支原体的最低检测限度为10个CCU(颜色变化单位)。支气管肺泡灌洗液检测结果表明,经肺内免疫的猪支气管肺泡灌洗液扩增结果均为阳性。     

猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立

建立了病猪肺脏组织的处理方法和DNA提取方法,根据猪肺炎支原体的P36基因设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,使用建立的方法检测了临床样品。结果表明,建立的检测方法能成功从猪支原体肺炎可疑肺组织中扩增出目的条带,成功建立了猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法,为该病的诊断提供了条件。     

滑液支原体烯醇化酶在感染宿主中的反应原性和细胞黏附性

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase, Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白结合位点和B细胞表位。MS Eno在不同MS菌株间同源性较高,且有别于其他物种。B细胞表位广泛分布在Eno蛋白的各个部分,且大都与预测的蛋白结合位点有重合。进行Eno原核表达和纯化,制备兔抗Eno多克隆抗血清。利用Western blot分析Eno在MS感染鸡或灭活苗免疫鸡中的反应原性。结果显示,MS Eno与兔抗Eno多克隆抗血清、兔抗MS多克隆抗血清、灭活疫苗(HN01株或YBF-MS1株)高免鸡血清、HN01强毒攻毒后阳性鸡血清、3个不同地方来源的临床阳性鸡血清均能发生反应,说明其在疫苗免疫和病原感染鸡中均表现有反应原性。利用菌落印迹和双荧光检测分析并证实Eno为外膜蛋白。利用间接免疫荧光和ELISA板结合试验分析Eno对鸡滑膜鞘细胞(synovial sheath cells, SSCs)是否具有黏附素作用。试验证实...     

猪肺炎支原体168弱毒株P46基因的克隆和鉴定

猪肺炎支原体的表面抗原基因Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应,其分子量约４６ｋＤａ,根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的Ｐ４６序列设计１对能扩增１３７７ｂｐＰ４６结构基因的引物作ＰＣＲ,成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体ＤＮＳＡ中扩增出目的基因。ＰＣＲ产物克隆于ｐＵＣ１９质粒中,部分测序表明克隆基因与Ｊ株基因因同源性达９６％。     

基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中SIgA

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是黏膜免疫的主要效应分子，在临床上常常作为疾病早期诊断的靶标，此外，基于SIgA的治疗性单抗和靶向SIgA产生的黏膜疫苗也越来越受到关注。分离并纯化出完整且具有活性的SIgA是产品研发的前提。为了提高猪初乳中SIgA的纯化效率，本研究采用串联亲和层析，强阴离子柱和精细分子筛层析进行纯化，从10 mL初乳中获得3 mg具有活性的SIgA。使用Western blot对纯化的SIgA进行鉴定，结果表明，纯化的SIgA与抗猪的重链蛋白单抗和抗SC单抗均具有良好的反应性。使用ELISA测试SIgA与抗猪的IgA重链单抗的反应性，结果发现使用本方法纯化的SIgA较原先方法(即硫酸铵沉淀，DEAE52弱阴离子层析，SephadexG-200凝胶层析和多次亲和层析的纯化方法)具有更高的反应性。最后使用质谱鉴定纯化的蛋白，结果表明为猪的SIgA。本研究为从猪初乳中纯化SIgA建立了一种高效的纯化方法，也为其它来源的SIgA的纯化提供参考。     

猪支原体肺炎活疫苗(168株)滴鼻免疫保护效果的研究

本研究通过滴鼻免疫新途径免疫猪支原体肺炎活疫苗168株,与肺内免疫组及对照组进行比较,来确定滴鼻免疫猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫保护力。将20只猪随机分为肺内免疫组、滴鼻免疫组、健康对照组和攻毒对照组。定期观察和检测各组猪免疫后的临床症状。结果表明:滴鼻免疫组免疫后,猪群体温正常,无免疫引起的局部或全身不良反应,免疫途径安全可行;滴鼻免疫组和肺内免疫组与健康对照组相比,SIgA水平显著升高,差异极显著(P0.01),但滴鼻免疫组与肺内免疫组相比,差异不显著。流式细胞仪检测显示CD4+数值未发生显著性变化。肺脏剖检评分显示滴鼻免疫组的肺脏的病变水平与攻毒对照组相比呈极显著降低(P0.01),保护率达到60%,相对低于肺内免疫组100%的保护率。猪支原体肺炎活疫苗(168株)通过滴鼻免疫方式,可以产生较好的免疫保护力。     

猪支原体肺炎活疫苗经肌肉注射的免疫效果评价

猪支原体肺炎活疫苗(168株)是一种以肺内注射途径免疫的弱毒活疫苗。为了拓展猪支原体肺炎活疫苗的免疫途径,评估猪支原体肺炎活疫苗(168株)配合佐剂以肌肉注射方式免疫猪群后的攻毒保护效果,选取20头7日龄猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)阴性仔猪,将其随机平均分成4组,分别为健康对照组、感染对照组、肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组。在免疫后采集血样并检测其中的Mhp IgG抗体,在首次免疫后42 d人工感染Mhp组织毒(JS株),攻毒28 d后评估肺脏的病变情况并测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中的Mhp含量。结果显示：免疫后肌肉注射免疫组动物产生了明显的Mhp特异性血清IgG抗体,而肺内注射免疫组动物在攻毒前未见明显的血清抗体;肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组的攻毒保护率分别平均为88.89%和75.93%,且组间无显著性差异;感染对照组的BALF中Mhp单位含量极显著高于肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组(P<0.01),2个免疫组间无显著性差异。结果表明：猪支原体活疫苗配合佐剂后经肌肉注射免疫可产生较好的免疫攻毒保护效果。本研究为猪支原体肺炎活...     

猪气喘病的防制

猪气喘病(猪支原体肺炎MPS,猪地方性肺炎EPS,过去曾称病毒性肺炎或PPLO)是一种直接接触、慢性呼吸道传染病。该病的病原为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp),主要表现咳嗽、气喘及肺部肉样或肝样病变。猪气喘病在世界范围内广泛流行,发病率高、难根除,造成日增重及饲料效率降低。特别在现代高度集约化和机械化养猪环境中,单位面积养猪     

几种佐剂对肌肉注射猪支原体肺炎活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强现有猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力以实现肌肉注射免疫,向现有活疫苗中添加几种不同佐剂,考察其经肌肉免疫后机体的免疫应答情况。结果表明,免疫刺激复合物基质佐剂和左旋咪唑+壳聚糖混合佐剂能有效激发细胞免疫应答和体液免疫应答;左旋咪唑+黄芪多糖混合佐剂能增强疫苗的细胞免疫刺激能力,而对体液免疫无作用;皂角素佐剂未显示明显的免疫增强效果。本试验结果为肌肉注射猪支原体肺炎活疫苗的开发奠定了数据基础。     

家畜支原体菌种保存期的测定

据国内外报道,支原体菌种以真空冻干保存方法为最好。国外报道一般保存期测定为4～6ａ,国内范文明等(1988)报道他们所测定的6个菌株的保存期达到9ａ零260ｄ。1999年9月至2000年1月,我们对22个保存菌株进行了一次全面的保存期测定,现将结果介绍于后。1　材料与方法所测定的材料是1979年3月10日至1996年3月28日不同时间真空冻干-20℃保存的菌种,共22株,其名称及来源见表1。选择无潮解、不萎缩变形和真空度合格的冻干菌种作试验材料。用灭菌的Ｈａｎｋ′ｓ溶液或ＫＭ2培养基溶解稀释至冻干前的分装量。菌种接种量按分装培养基量的1/5～1/3加入,…