羊草乙醛脱氢酶（ALDH）基因片段的克隆及表达分析

[研究目的]克隆羊草的乙醛脱氢酶ALDH基因片段,研究该基因在不同条件下的表达情况。[方法]采用RT-PCR技术克隆羊草的ALDH基因片段,并对其核苷酸和氨基酸序列进行分析,采用RealTimeRT-PCR方法研究该基因的表达。[结果]获得了羊草的ALDH基因片段,长度为675bp,编码225aa。核苷酸序列比较表明,与水稻ALDH1a序列(AB037421)同源性为86%,与玉米RF2C(AF348413)同源性为85%。BLASTp分析,该序列与水稻、玉米、拟南芥的乙醛脱氢酶一致性分别高达87%、86%、60%,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。RealTimeRT-PCR数据表明,在诱导条件下该基因的表达量呈先升高后降低的趋势。总体上来说,该基因对盐的响应要高于干旱和冷冻。[结论]成功获得了羊草ALDH基因片段,并研究了该基因的表达情况,为进一步克隆羊草ALDH全长基因奠定了基础。     

不同日龄仔猪骨髓组织抗菌肽Protegrin-1mRNA的表达

分别于出生当天、3、14、23和28日龄随机屠宰杜×长×大三元杂交公猪4头，采集股骨骨髓组织。用一优化的RT—PCR方法，以18S rRNA作内标，定量分析不同日龄仔猪骨髓组织抗菌肽Protegrin-1（PG-1）mRNA表达的差异。结果表明，不同日龄仔猪骨髓组织PG-1mRNA相对丰度有明显的差异。出生时最低，随着日龄的增加，其表达显著增加。     

猪TGFβ1基因及其受体组织表达特性的研究

以妊娠母猪为研究材料,采用RT-PCR半定量方法对猪转化生长因子β1(TGFβ1)及其3种受体组织表达特点进行研究。结果表明:TGFβ1在11种组织中的表达量,由高到低依次为肾上腺、下丘脑、肌肉、卵巢、脾、大脑、肾、子宫、肺、肝和心脏。3种受体的表达,总体上来说在子宫中相对较高。TGFβ1及其受体在肾上腺和子宫等组织中有相对较高的表达量,提示其在繁殖过程中可能发挥作用。     

检测绵羊源爱知病毒D型荧光RT-PCR方法的建立和应用

绵羊源爱知病毒D型(ovine Aichivirus D)是在国内绵羊中新发现的病毒,本研究根据绵羊源Aichivirus D 3D基因序列设计检测引物,通过反应体系和条件优化,成功建立了检测绵羊源Aichivirus D的TB Green染料法荧光RT-PCR方法,该方法特异性和稳定性良好,灵敏度高。对2020年4月―2021年5月采集自四川6个场253份绵羊粪便样本(健康羊的133份,腹泻羊的120份)进行检测,结果该病毒的平均检出率为8.7％,场阳性率为66.7％。其中,腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(17.5%)显著高于非腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(0.75%,P<0.001)。表明绵羊源Aichivirus D可能是引起以上地区绵羊腹泻的病原。从绵羊源Aichivirus D的阳性样本中成功克隆出大小为1 422 bp的13个完整的绵羊源Aichivirus D 3D基因,其核苷酸相似性为99.4％～100.0％。遗传演化分析发现这13株绵羊源Aichivirus D 3D基因与本实验室前期研究上传的绵羊源Aichivirus D 3D基因共同聚为单独的一个大支。本研究为绵羊源Aichivirus D的分子检测提供了一种新的方法和基础流行病学数据。     

木质素合成酶基因F5H的RT-PCR引物筛选

据EMBL核酸序列库中发表的白杨杂种F5H的cDNA序列,利用Primer 5.0软件设计3组扩增引物。通过PCR及RT-PCR扩增反应,筛选出一组比较合适的引物,确定该引物对的最适反应体系和程序参数。利用该引物对,从正在分化的2年生欧美杨107茎的次生木质部提取的mRNA中RT-PCR扩增出一个867bp的木质素合成特异表达的f5h基因片段。将其克隆到pGM-T载体上,构建了f5h在大肠杆菌中的表达载体,并对引物筛选进行讨论。     

荧光定量PCR法检测点带石斑鱼神经坏死病毒研究

根据己公布的神经坏死病毒全基因序列,应用引物设计软件依据Gene Bank所收录的各种石斑鱼神经坏死病毒RNA2基因组全序列选择保守区域,根据Taqman探针引物设计原则,设计Taq Man探针及其引物。采用Taq Man探针技术,并且将假病毒技术构建的含有神经坏死病毒RNA2基因组的MS2噬菌体假病毒作为阳性质控品,建立Taq Man探针检测点带石斑鱼神经坏死病毒的荧光定量PCR方法,拟合标准曲线,能够在病毒检测中进行绝对定量,能检测到10个病毒拷贝模板数,在临床检测中得到很好运用。本研究建立实时荧光定量RT-PCR,有助于日常检验工作,为鱼类神经坏死病毒的筛选和监测提供基础,有助于控制神经坏死病的疫情传播。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用

为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。     

Tomato mottle mosaic virus: Characterization,resistance gene effectiveness,and quintuplex RT-PCR detection system

Tomato mottle mosaic virus (ToMMV), an economically important species of the genus Tobamovirus, causes significant loss in yield and quality of tomato fruits. Here, we identified the Shandong isolate of ToMMV (ToMMV-SD) collected from symptomatic tomato fruits in Weifang, Shandong Province of China. ToMMV-SD caused symptoms such as severe mosaic, mottling, and necrosis of tomato leaves, yellow spot and necrotic lesions on tomato fruits. The obtained full genome of ToMMV-SD was 6 399 nucleotides (accession number MW373515) and had the highest identity of 99.5% with that of isolate SC13-051 from the United States of America at the genomic level. The infectious clone of ToMMV-SD was constructed and induced clear mosaic and necrotic symptoms onto Nicotiana benthamiana leaves. Several commercial tomato cultivars, harboring Tm-2² resistance gene, and pepper cultivars, containing L resistance gene, were susceptible to ToMMV-SD. Plants of Solanum melongena (eggplant) and Brassica pekinensis (napa cabbage) showed mottling symptoms, while N. tabacum cv. Zhongyan 100 displayed latent infection. ToMMV-SD did not infect plants of N. tabacum cv. Xanthi NN, Brassica rapa ssp. chinensis (bok choy), Raphanus sativus (radish), Vigna unguiculata cv. Yuanzhong 28-2 (cowpea), or Tm-2² transgenic N. benthamiana. A quintuplex RT-PCR system differentiated ToMMV from tomato mosaic virus, tomato brown rugose fruit virus, tobacco mosaic virus, and tomato spotted wilt virus, with the threshold amount of 0.02 pg. These results highlight the threat posed by ToMMV to tomato and pepper cultivation and offer an efficient detection system for the simultaneous detection of four tobamoviruses and tomato spotted wilt virus infecting tomato plants in the field.     

利用小RNA深度测序快速鉴定草莓病毒

病毒侵染直接影响草莓的生长发育及果实品质,快速检测及鉴定病毒是病毒防治的前提。本研究以‘丰香’草莓和‘哈尼’草莓为试材,利用小RNA(sRNA)测序结合RT-PCR技术对2种栽培草莓品种中存在的病毒进行了研究。对sRNA测序结果进行组装和注释,结果表明:在混合样品中共有242个contigs比对到5种草莓病毒,分别为草莓白化病毒(strawberry pallidosis associated virus,SPaV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓毛形病毒3(strawberry crinivirus 3,SCrV 3)和草莓毛形病毒4(strawberry crinivirus 4,SCrV 4)。利用RT-PCR技术对sRNA测序结果进行验证,结果表明:SMoV、SVBV和SCrV 3在‘丰香’草莓和‘哈尼’草莓中均检测到,而SPaV和SCrV 4只在‘哈尼’草莓样品中检测到。本研究利用sRNA测序技术鉴定了2个草莓品种中存在的病毒,首次在我国生产的同一个草莓品种中检测到5种病毒,为草莓病毒的检测和防控提供了新的思路。