规模化猪场大肠杆菌的耐药性监测及血清流行病学调查

为了调查猪致病性大肠杆菌的耐药性及流行血清型 ,从湖北、河南、江西、安徽、浙江等省的 33个猪场采集 32 1份仔猪黄、白痢病料进行细菌的分离和生化鉴定 ,结果分离到大肠杆菌 30 2株 ,其中致病性大肠杆菌 2 76株。对 112株致病性大肠杆菌进行了 15种抗生素敏感性试验 ,发现分离菌株对 15种药物均有不同程度的耐药性 :青霉素 G对其完全没有抑制作用 ;先锋霉素 抑制作用最强 (97.3% ) ,其次为呋喃妥因 (78.6 % )、痢特灵 (71.4 % )、环丙沙星(6 8.8% )、诺氟沙星 (6 5 .1% )。 112株菌中 ,有 4 7种耐药谱型 ,多数为 6耐以上的菌株 (80株 ) ,占供试菌株的 71.4 %。应用微量平板凝集试验 ,对分离的 2 76株致病菌进行了血清型鉴定 ,鉴定共有 72种血清型 ,其中优势血清型 10种 ,占能定型分离致病菌株的 5 3.7%。     

猪卵泡卵母细胞体外成熟与冷冻保存

研究了激素、猪卵泡液、不同类型血清对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响 ;比较了卵泡直径小于 2 mm、2～ 5 mm和大于 5 mm的卵母细胞体外成熟能力的差异 ,并对不同发育阶段猪卵母细胞的冷冻保存进行了研究。结果表明 :猪卵母细胞体外培养 4 8h时 ,培养的前 2 4 h培养液中加入激素 ,后 2 4 h去掉激素 ,卵母细胞的 A级成熟率 (5 1.73% )和总成熟率 (83.2 5 % )最高 ,极显著高于前 2 4 h不加激素 ,后 2 4 h添加激素培养的成熟率 (P<0 .0 1) ;也显著高于不含激素的培养液连续培养 4 8h的成熟率 (P<0 .0 5 ) ;但与添加激素连续培养 4 8h的成熟率差异不显著 (P>0 .0 5 )。在体外成熟培养液中 ,添加 10 % (体积分数 ) ECS的成熟率 (72 .86 % )显著高于添加 10 % (体积分数 ) NCS的成熟率(6 2 .2 1% ) (P<0 .0 5 ) ,而添加 10 % p FF则抑制卵母细胞的体外成熟。随着卵泡直径的增大 ,卵母细胞体外成熟能力逐渐增强。采用程序冷冻保存方法 ,成熟卵母细胞的成活率 (35 .5 9% )显著高于培养前 (2 4 .6 4 % )和培养 2 4 h(2 3.36 % ) (P<0 .0 5 )。培养 2 4 h(77.2 2 % )和培养成熟 (72 .81% )的卵母细胞解冻后的形态完整率均显著高于培养前(5 3.2 4 % ) (P<0 .0 5 )     

大熊猫犬冠状病毒的分离与鉴定

以犬肾传代细胞(MDCK)从1只病死大熊猫肝脏中分离到1株病毒,命名为DXMV。电镜观察磷钨酸负染的病毒细胞培养物，发现冠状病毒样粒子，超薄切片上可见细胞浆内病毒包涵体。理化学和生物学鉴定结果表明，DXMV核酸类型为RNA，对氯仿、乙醚敏感，可耐受1％胰蛋白酶的作用，具有一定的耐酸性和耐热性，可在MDCK、FCWF、F81细胞中增殖，无血凝性和血吸附特性。血清中和试验结果表明，DXMV可被犬冠状病毒阳性血清中和。采用犬冠状病毒间接荧光抗体法染色DXMV细胞飞片，可在细胞浆内见到特异性荧光。以冠状病毒通用引物和犬冠状病毒特异性引物，可从大熊猫肝脏和不同代次的病毒细胞培养物中扩增出与预期值251bp和515bp大小相同的核苷酸片段。由此说明，该病毒为犬冠状病毒，大熊猫可被犬冠状病毒感染。     

应用聚合酶链式反应(PCR)技术检测野猪的氟烷基因

猪应激综合征(Procine Stress Syndrome,PSS)是指猪在应激因子的作用下发生恶性高热综合症(Malignant Hyperthermia Syndrome，MHS)。试验随机选取18头纯种野猪提取基因组DNA进行聚合酶链式反应，扩增得到RYR。基因特异片段，经过HhaⅠ酶切阳性鉴定可断定这18头猪的RYR1基因都没有发生突变，因此不存在猪应激综合征问题。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征

对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株HB2(sh)／2002的全基因组序列进行了测定与分析。该毒株基因组全长为15373nt(不包括PolyA尾)，与国内外美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于88．7％～95．1％之间。序列分析表明，该毒株是1个天然存在缺失的变异毒株，其ORFla的Nsp2存在编码12个氨基酸的连续36个核苷酸的缺失，ORF、3存在编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失。这是国内外首次发现PRRSV存在缺失变异现象，研究结果补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据，为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PKRSV）ATCC VR-2332的ORF5基因序列，设计并合成了一对引物．对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增．获得约748bp的DNA片断，将其分别克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332、CH-1a、MLV、Lv等毒株的ORF5序列进行比较，结果表明：SHDl与F114、MLV、ATCCVR-2332同源性高达98．5％，与CH-1a同源性为91．0％，与其它毒株同源性为86．6％~88．4％；F114与MLV、ATCCVR-2332同源性为99．3％～99．7％．其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群．显示近年来各地PRRSV分离毒株与cH-1a株的遗传差异越来越大。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3．1（＋），构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和pCBVP220RF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠，分别注射pCDNA3．1（＋）、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP220RF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。     

PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示及ELISA方法的建立

用PCR扩增猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到pR质粒,转化DH5α细胞,筛选阳性克隆进行PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,经SDS-PAGE和Western blotting分析,表明衣壳蛋白片段在噬菌体表面正确展示,表达的融...     

Study on Anti-viral Effect of Rhubarb on Porcine Epidemic Diarrhea Virus in vitro

The inhibitory effects of rhubarb on cell lesion, which was caused by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and its mechanism had been studied in this research.The maximum safe concentration of rhubarb solution applied to Vero cells was determined through morphological observation, and then the PEDV infected Vero cell model in vitro was established, by which the inhibitory effect of rhubarb on virus was studied.The experimental method had also been established based on this cell model.The result showed that the maximum safe concentration was 3.28 mg/mL.Both morphological observation and MTT assay were indicated that rhubarb could not only block the attachment of the virus to Vero cell and inhibit the synthesis and reproduction of the virus, but also could directly inactivate the virus.This research showed that rhubarb had an inhibitory effect on PEDV, and provided a theoretical basis for the prevention and treatment of clinical porcine epidemic diarrhea.