异源转座子存在的证据

本研究选用130对小麦SSR引物对从5个小麦-黑麦易位系中选取的56个单株进行PCR扩增,中国春,绵阳11和黑麦作为对照。结果发现122-2A和636-2A引物对在小麦和黑麦间产生多态性。122-2A引物在黑麦中产生2个黑麦特异条带,一个条带大小为190bp,另一个为330bp。在56个单株中有4个单株产生相应的黑麦特异带。这可能是黑麦中1个可移动因子(异源转座子)导入了小麦所致。并且结合许多病理学、进化生物学及其遗传学的证据对异源转座子在原核和真核生物中广泛存在的可能性进行了讨论。     

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型信号标签诱导突变体库的构建

本研究以自杀性质粒pUT携带含有信号标签的Mini-Tn5转座子对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌进行转座诱变,构建了带有12对特异性信号标签的Mini-Tn5转座子的pUT自杀质粒,转化到供体菌E.coliβ2155后,利用双亲本滤膜杂交法与受体猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌(APP1)进行接合转移,构建并优化了接合转移体系.利用抗性和营养缺陷培养平板筛选得到接合突变体,通过抗性通用引物与12个特异标签引物和胸膜肺炎放线杆菌毒素IV(ApxIV)鉴定引物分别对这些突变体进行了PCR鉴定和测序验证.结果表明,经过加入标签的MinI-Tn5转座子可以通过接合转移的方式从供体菌E.COliβ2155中插入到APP1基因组当中,并成功构建了12个含有特异信号标签的重组质粒,获得了APP1的12个转座突变体库,经筛选鉴定后得到561个突变株.这为研究APP1的功能基因和筛选特定突变株提供了必要的基础.     

利用AhMITE1转座子分子标记鉴定花生F1代杂种

对杂交后代进行杂种的真实性鉴定是杂交育种成功的前提。AhMITE1转座子标记是一类基于PCR的分子标记,其在花生中扩增的产物片段差异大,多态性强,采用琼脂糖凝胶电泳即可区分。本研究用7对多态性转座子引物对6个花生组合的166个F1单株进行了真实性鉴定。根据杂种植株含有父母本带型为依据共鉴定出了77个单株为真杂种,真杂种植株数占植株总数的比率为44.86%;收获时根据田间表型鉴定出了79个单株为真杂种,真杂种比率为47.59%。     

裂叶牵牛突变体的研究

[目的]研究裂叶牵牛花色、叶色等变化机理。[方法]通过田间调查,利用PCR技术从裂叶牵牛蓝白相间突变株幼叶组织中扩增出目的片段,构建重组质粒pMD18-T/Tpn。[结果]田间调查结果发现,变异株的F3代发生分离,叶色突变并不影响花色的变化;PCR扩增结果表明,以蓝白、纯蓝、大花基因组DNA在330 bp处各有1条特异带,而春光、白雪、平安红、垂蔓都没有特异带出现。[结论]变异株重组质粒序列为裂叶牵牛的转座子序列片段。     

反刍月形单胞菌乙酸生成缺陷株的构建及相关酶活性分析

[目的]构建反刍月形单胞菌乙酸生成的缺陷株并分析其发酵特性。[方法]应用转座子标签法,通过转座子供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌反刍月形单胞菌进行转座子诱变,采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子。[结果]共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌7株。对反刍月形单胞菌的突变株进行16S rRNA鉴定和Tn5的PCR鉴定,及乙酸激酶（AK）和磷酸乙酰转移酶（PTA）酶比活力分析,确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。[结论]该研究为进一步研究反刍兽瘤胃微生物乙酸的细胞代谢网络和调控奠定基础。     

PiggyBac转座子介导的诱导细胞永生化转基因载体的构建及其整合效率的检测

【目的】构建在小鼠水平上实现多个目的基因的表达以及标记基因安全删除的转基因载体。【方法】以载体为模板,分别扩增SV40P neo、IRES、tk-PloyA,通过overlap PCR连接,并在两端添加方向相同的LoxP序列,构建转基因基本载体PB-NIT;然后通过overlap PCR扩增获得Tet-CMV-SV40 T-T2A-p 53-PolyA基因表达盒,将其插入PB-NIT中,构建载体PB-NIT-STP;最后将转录因子激活域 rtTA 通过同尾酶连接插入PB-NIT-STP,构建载体PB-rtTA-NIT-STP。【结果】经酶切和测序等鉴定,以上载体均正确;经转座活性鉴定,共转染转座子载体PB-rtTA-NIT-STP和转座酶载体比只转染转座子载体获得的阳性克隆数提高了20倍。【结论】得到了基于PiggyBac转座子的可用于正负向筛选和诱导目的基因表达的转基因载体。     

转座子mini-Tn10介导的运动突变对溶藻弧菌毒力的影响

采用转座子mini-Tn10/Km构建了致病性溶藻弧菌的突变库,采用半固体双层平板初筛到73株运动缺陷突变株,初筛的突变株纯化及重复筛选后获得运动性缺陷表型稳定的突变株ND-01MM,Southern鉴定确定其为单位点插入。野生型菌株ND-01和运动缺陷突变株ND-01MM对致病性溶藻弧菌的天然宿主大黄鱼粘液的趋化、粘附以及在大黄鱼吞噬细胞内存活能力等生理功能的比较研究发现,溶藻弧菌运动缺陷后趋化及粘附能力均极显著下降(P<0.01),但在吞噬细胞内的存活能力则与野生型菌株差异不显著(P>0.05)。采用腹腔注射和浸泡两种方式感染大黄鱼,结果发现运动缺陷对浸泡感染的影响较为明显,但对腹腔注射的感染方式影响不大。     

百脉根根瘤菌MAFF303099 Tn5转座子插入突变体库的构建及筛选

以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有Tn5-sacB插入,三亲本转化效率为3.75×10~(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。