一种基于RPA的番茄褪绿病毒检测方法

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,同时分析了该方法的灵敏度和特异性。结果表明,建立的ToCV-RPA方法在38℃恒温下40 min可从ToCV阳性的番茄样品中扩增出246 bp的特异性条带。扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR方法的10倍,适用于ToCV的快速检测。     

番茄褪绿病毒在湖南省首次发生

2016年7月在湖南省蔬菜病害调查中发现,4种茄科蔬菜表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状,疑似被番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)感染,同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用To CV热激蛋白(heat shock protein 70,HSP70)序列的特异性引物对采集的番茄、茄子、辣椒、马铃薯样品和烟粉虱样品进行RT-PCR检测,均扩增出目标条带,且扩增序列与北京番茄To CV分离物(KC887999.1)部分序列相似度为99.0%,确认采集样品被To CV感染。4种茄科蔬菜To CV的感染率达70%~100%;发病叶片上烟粉虱的带毒率为66.7%~87.5%;鉴定出烟粉虱的生物类型为MED烟粉虱。这是湖南省首次确认该病毒,需要引起关注和加强防范。     

内含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒样颗粒作为荧光定量RT-PCR内标的制备与鉴定

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合成和klenow酶连接技术制备内标片段,将内标片段插入pET32a-MS2重组质粒,构建pET32a-MS2-IC重组质粒,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经RNase和DNase消化后,采用荧光RT-PCR检测耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标的含量。结果表明,制备了高表达量耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标,可用于新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立。     

锦鲤疱疹病毒GY1506株的分离鉴定

对江苏省某养殖场患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定。现场采样发现,发病鱼体表黏液增多,眼球凹陷,背鳍和鳃部溃烂。剖检后见肝脏、肾脏、胆囊肿大,肠充血。取病鱼组织匀浆上清接种CCB细胞,14 d后可观察到细胞变圆、脱落、空泡化等典型的细胞病变。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,鳃和肠均能扩增出预期大小的特异性产物。序列分析显示,扩增序列与KHV-J毒株胸苷激酶(TK)基因核苷酸序列同源性为100%。根据TK基因序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,命名为KHVGY1506株。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。     

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒

根据猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)3种病原体的基因保守序列，分别设计了与CSFV的E2基因、PPV的VP2基因和PRV的gⅡ基因序列互补的3对引物。用这3对引物对人为混合的样品中的PPV和PRV的DNA模板及CSFV反转录后的cDNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应奈件的优化，结果同时得到3务与试验设计相符的288bp(CSFV)、575bp(PPV)700bp(PRV)特异性条带；敏感性检测结果表明，该多重PCR可以检测到14．5ng／L的CSFV、27．1pg／L的PPV、31．4ng／L的PRV的核酸模板。     

狂犬病病毒SRV9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析

根据已发表的狂犬病病毒核蛋白基因序列，设计并合成了一对引物，从SAD株驯化的SRV9。蚀斑株中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增出核蛋白的全长cDNA序列，测序结果显示，其序列与国外报道的SAD母源株序列一致。将核蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28b( )中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，于30℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达，大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析，在分子量约为56kDa处出现一新的蛋白带。和预期的目的蛋白分子量相符，Western-blotting检测表明，表达产物能与狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，扫描分析显示，表达产物占菌体总蛋白的23%，包涵体分离，纯化后，纯度达89%，上述结果为核蛋白在狂犬病基因免疫和免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

猎豹与虎猫杯状病毒的分离及其超变区基因比较研究

用F81细胞从上海某动物园患口腔溃疡的猎豹和虎的唾液病料中分离获得两株杯状病毒，经形态学、理化学、生物学鉴定和病毒核酸超变区基因RT-PCR扩增与序列测定证明两株病毒均为猫杯状病毒(FCV)，分别命名为FCV/cheetah/Shanghai/02/2002与FCV／tiger/Shanghai／03/2002。人工感染猫可引起体温升高，口腔溃疡，食欲下降等症状。两株病毒的超变区序列520bp长片段问的同源性为99.2％，与国内桂林虎分离株(TFCV9710)的同源性为74．0％，与国外分离株的总体同源性为58．1％，说明不同宿主或同种不同个体间杯状病毒分离株超变区核酸差异十分显著，符合猫杯状病毒的分子生物学特征。     

6株牛传染性鼻气管炎病毒BICP4基因序列的同源性分析

牛传染性鼻气管炎病毒的立即早期启动基因IER4.2编码感染细胞蛋白BICP4基因。各种疱疹病毒的BICP4基因的Ⅰ，Ⅲ，Ⅴ区变异性较大，并为其特征区。为了比较分离自不同牛种，不同部位的5种病毒株BICP4蛋白I区基因的差异性，本文根据已发表的IBBV K22毒株重复序列IRs中BICP4的基因序列设计了一特异性引物，对各毒株进行PCR扩增，均得到约540bp的片段，将其克隆，测序并连同K22株进行同源性比较。结果表明，6株病毒的核苷酸序列及氨基酸序列同源性均在98%以上，说明这些毒株重复序列中的早期基因高度保守，在一定程度上也显示出IBRV的高度保守性。     

大批仔鸭病毒性肝炎和鸭瘟并发病例

我县经济开发公司畜牧水产分公司肉鸭场,于4月27日进栏樱桃谷雏鸭1750只,养至5月18日,整群仔鸭上喙部出现特征性的萎缩、变形、喙边缘呈波浪状,严重的上翻。5月20日开始出现死亡,24日死亡数达到高峰,最多的一天死亡108羽,最少也有8羽,至6月6日止,总数达1034羽,死亡率达59.09％。癌状:病初病鸭鼻流水涕,继而上喙皮肤糜烂、结痂、剥离痂皮呈现溃疡面,三天以后喙便出现萎缩、变形、上翻,上喙边缘不整,呈波浪状,喙色变白,采食困难,眼流泪,眼睑周围有象戴眼镜似的黄色粘结羽