酵母SOD1基因缺失突变体应答真菌细胞壁抑制剂CFW的转录组学分析

以酿酒酵母为研究材料,采用酵母全基因组表达谱芯片,分析超氧化物歧化酶SOD1基因缺失(sod1Δ)对酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂钙荧光白(CFW)全基因组转录表达谱的影响,为揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。结果表明:CFW(10μg/m L)处理1 h后,与野生型酵母细胞相比,sod1Δ酵母细胞中211个基因发生了显著差异表达(97个基因表达上调、114个基因表达下调)。随机选取5个差异表达基因采用定量PCR验证,结果与芯片分析结果一致。差异表达基因功能主要涉及细胞壁、细胞代谢、蛋白质合成、细胞防御以及大量功能未知蛋白。以上结果表明,SOD1基因缺失可显著改变酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW胁迫的全基因组转录表达谱。     

九寨沟沉水杉叶藻的叶绿素荧光参数日变化研究

以来源于九寨沟芳草海、箭竹海和五花海3个湖泊的优势沉水植物杉叶藻(Hippuris vulgaris)为试材,利用Junior-PAM调制叶绿素荧光仪,在夏季对其快速光响应曲线和最大光化学效率(Fv/Fm)日变化动态进行测定,以揭示杉叶藻的光合特征及其与主要环境因子的关系。结果显示:3个湖泊光合有效辐射强度(PAR)日平均值之间无显著差异,五花海的水温(Tw)日平均值极显著高于芳草海和箭竹海。沉水杉叶藻的最大相对电子传递速率(r ETRmax)和半饱和光强(Ek)的日变化在箭竹海和五花海均呈双峰曲线,在芳草海呈单峰曲线;3个湖泊沉水杉叶藻光能利用效率一天中均呈早晚高、中午低的近"V"形曲线。五花海沉水杉叶藻的r ETRmax和Ek日平均值极显著高于箭竹海和芳草海,r ETRmax、Ek在箭竹海和芳草海之间无显著性差异,说明五花海沉水杉叶藻有更强的光合能力和对强光的耐受能力。3个湖泊沉水杉叶藻Fv/Fm日变化都呈"V"形曲线,五花海沉水杉叶藻Fv/Fm恢复速度大于芳草海和箭竹海。研究表明,不同的环境因子,特别是Tw,会导致沉水植物杉叶藻的叶绿素荧光参数在3个湖泊之间存在显著差异,即Tw是九寨沟沉水植物杉叶藻光合作用的主要影响因子,12℃为光合最适温度。     

养殖池塘底泥水体中适用于TaqMan荧光定量PCR的 不同DNA提取方法

通过人工模拟即在养殖池塘底泥和水样中加入阳性组织处理样品,对人工模拟的底泥样品分别采用磁珠法、酚氯仿法以及吸附柱法进行核酸提取,结果发现底泥含量对磁珠法和吸附柱法病毒DNA提取效果影响较小,而对酚氯仿法病毒DNA提取效果影响较大,且底泥含量较少提取相对较好。3种病毒DNA提取方法中采用混样提取核酸的效果均好于用上清液提取的效果。吸附柱法和磁珠法对病毒DNA提取效果较接近且明显好于酚氯仿法。通过对不同浓度的PEG6000进行浓缩后提取核酸,结果发现原始水样中未检测到CyHV 2或其含量极低未达到检测限。PEG6000浓度为13%时,核酸浓缩提取效果最佳。本研究为实时监测养殖池塘中的底泥和水体中是否存在病毒提供了一种参考方法,从而更好地维护水产养殖环境的生态安全和促进我国水产养殖业健康可持续发展。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

烟粉虱溶菌酶基因的鉴定及表达分析

【目的】鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的溶菌酶基因,并对其序列特征、进化关系和表达模式进行分析,探索该基因在烟粉虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用,为进一步解析烟粉虱先天免疫过程提供理论依据。【方法】以第2代高通量测序的结果为依据,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值＜10^-5的基因为烟粉虱溶菌酶基因（lysozyme gene of Bemisia tabaci,BtLyz）,利用ORF Finder预测BtLyz的开放阅读框,并得到氨基酸序列;利用Pfam和SMART预测BtLyz的蛋白质结构域;利用SinglP 4.1 Server预测BtLyz序列的信号肽;利用MEGA6.0软件进行BtLyz的氨基酸多序列比对;利用MEGA6.0软件,对BtLyz与其他昆虫的31个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用邻接法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析球孢白僵菌侵染烟粉虱卵、若虫、成虫后,在12、24、36、48、60 h时目标基因的时空表达模式。【结果】鉴定出烟粉虱4个溶菌酶基因,分别命名为BtLyz1、BtLyz2、BtLyz3和BtLyz4,基因序列全长分别为1 819、1 149、829和928 nt,分别编码159、160、148和160个氨基酸,且均含有信号肽。蛋白质结构分析、氨基酸序列比对和系统进化分析发现,BtLyz1和BtLyz4属于i型溶菌酶,BtLyz2和BtLyz3属于c型溶菌酶。BtLyz-1与豌豆长管蚜ApLyz-i1位于同一进化支上,BtLyz4与柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆长管蚜ApLyz-i2位于同一进化支上。BtLyz2和BtLyz3与褐飞虱NlLyz-c1和异色瓢虫HaLyz-c3位于同一进化支上。与对照相比,卵期4个溶菌酶基因和若虫期BtLyz4的相对表达量没有显著变化;若虫期BtLyz1的相对表达量先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,24 h时上调表达最明显,为对照组的4.55倍;成虫期BtLyz1和BtLyz4的相对表达量均为先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,60 h时上调表达最明显,为对照组的11.31和4.21倍;若虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调表达,在诱导24 h时上调表达最明显,为对照组的5.09和8.31倍,而后急剧下调,在60 h时下调表达最明显,为对照组的0.19和0.13倍;成虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调的表达趋势,在24 h时上调最明显,为对照组的5.56和8.84倍。【结论】从烟粉虱体内鉴定了4个溶菌酶基因序列,其中2个为c型溶菌酶序列,2个为i型溶菌酶序列;在球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态、不同时间后,卵期的相对表达量与对照相比没有显著变化;在若虫和成虫期,不同BtLyzs表现出不同的表达趋势。4个BtLyzs可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生物防治的潜在新靶标。     

RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。     

外源6-BA和不同用量氮肥配合对小麦花后叶片功能与荧光特性的调控效应

【目的】探讨外源细胞分裂素（6-BA）和不同用量氮肥对小麦花后光合特性的调控效应,为激素与氮肥配合施用提高小麦光合生产力提供理论依据。【方法】试验选用持绿型品种汶农6号和非持绿型品种济麦20,设置N0（0）、N1（240 kg·hm-2）、N2（360 kg·hm^-2）3个氮肥用量,同时,花后连续3 d叶面喷施25 mg·L^-1 6-苄基腺嘌呤（6-BA）及300 mg·L^-1洛伐他汀（Lovastatin）,用量100 mL·m^-2。开花后每隔7 d取旗叶,测定叶绿素含量、MDA含量、抗氧化酶活性等生理指标,用高效液相色谱法测定4种内源激素含量,利用脉冲调制式荧光仪测定不同处理下旗叶叶绿素荧光诱导的动力学参数。【结果】喷施外源6-BA显著提高两品种小麦旗叶花后不同时期最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSII）、光合电子传递速率（ETR）以及光化学猝灭系数（qP）,而喷施外源洛伐他汀对上述指标产生显著降低作用。喷施外源6-BA使N0、N1、N2处理下济麦20旗叶ΦPSII分别提高12.08%、14.21%、9.43%,汶农6号旗叶ΦPSII分别提高12.44%、14.84%、11.58%;喷施外源6-BA使N0、N1、N2处理下济麦20旗叶ETR分别提高16.57%、25.81%、18.83%,汶农6号旗叶ETR分别提高13.88%、23.58%、22.80%。两品种其他荧光参数指标表现出以下规律,即6-BA与N1配合对小麦旗叶Fv/Fm、ΦPSII、ETR以及qP的提高效应均高于单一喷施6-BA或6-BA与N2配合。同时,品种、氮肥、激素单一效应及激素与氮肥配合对ΦPSII、ETR、qP影响显著,品种、激素单一效应对Fv/Fm影响显著,而激素与不同用量氮肥配合对Fv/Fm无显著影响。叶面喷施细胞分裂素抑制剂洛伐他汀使N0、N1、N2处理下济麦20旗叶ETR分别降低22.71%、12.06%、11.92%,两品种其他荧光参数指标Fv/Fm、ΦPSII、qP均表现出下降趋势,而增施氮肥能够缓解因细胞分裂素合成减少导致的小麦荧光参数的降低。外源喷施6-BA对两品种小麦内源激素含量影响显著。喷施外源6-BA显著提高旗叶玉米素核苷（ZR）含量,生长素（IAA）含量以及N0、N1处理下21-28 d赤霉素（GA3）含量,显著降低脱落酸（ABA）含量,而喷施外源洛伐他汀后,4种内源激素含量变化与以上结果相反。随着施氮量增加,ZR含量、14-28 d IAA含量随之增加,ABA含量总体呈下降趋势,而7-14 d GA3含量在N1处理下最高。同时,品种、氮肥、激素单一效应、激素与氮肥配合对ZR含量影响显著。另外,6-BA与N1配合对小麦叶绿素含量和抗氧化酶活性的提高效应高于单一喷施6-BA或6-BA与N2配合,激素与氮肥配合施用显著影响叶绿素含量和抗氧化酶活性。与不施氮相比,N1与N2处理下,外源洛伐他汀对叶绿素含量和抗氧化酶系活性的降低幅度减小,即增施氮肥能够缓解因细胞分裂素合成减少引起的两品种小麦光合结构的衰老。花后喷施外源6-BA显著影响千粒重和产量（P＜0.01）,对穗数、穗粒数无显著影响,6-BA与氮肥配合显著影响穗数、穗粒数、千粒重以及产量,6-BA与N1配合显著提高产量及其构成因素。【结论】细胞分裂素与氮肥配合能够明显改善小麦的光合性能,6-BA与适量氮肥配合施用对小麦光合性能的提高效应显著高于单一喷施6-BA或6-BA与过量氮肥相配合,光合性能的改善显著提高两品种的产量。     

荧光定量PCR检测猪链球菌2型主要毒力因子方法的建立

[目的]建立荧光定量PCR检测猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)和胞外因子(Extracellular protein factor,EF)3种主要毒力因子的方法。[方法]根据cps2j、mrp和ef基因的基因序列,分别设计并合成3对引物及相应的Taqman探针,其中cps2j和mrp的5'端标记FAM荧光发射基团,ef的5'端标记HEX荧光发射基团,3种基因的3'端都标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的荧光定量PCR方法检测上述3种主要毒力因子,其中cps2j单独检测,mrp与ef的实行双重荧光PCR方法检测。[结果]cps2j、mrp和ef的最低检测限分别为12、51和51 CFU,灵敏度很高;与其他病原菌无交叉反应,重复性及特异性均较好;此外,整个检测过程在60 min内即可完成。[结论]该试验所建立的双重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型3种主要毒力因子。     

基于分子量分布的生活污水荧光光谱研究

采用超滤及微滤膜法对生活污水进行分级,以荧光光谱为基本分析手段,结合荧光区域积分(FRI)法研究不同分子量区间组分的荧光特性。结果表明,不同分子量区间水样的同步荧光光谱图(SFS)中均含有3类荧光峰,分别为类蛋白质峰、类富里酸峰及类腐殖酸峰,其中类蛋白质峰荧光最强;类蛋白质、类腐殖酸及类富里酸的SFS区间积分强度大小顺序为类蛋白质区域类腐殖酸区域类富里酸区域,表明生活污水中蛋白质含量最高,腐殖酸次之,富里酸最少;各水样三维荧光光谱(EEM)图中主要存在4类荧光峰,分别为Peak T1、Peak T2、Peak A、Peak C,其中类蛋白质峰强度明显强于类腐殖酸;荧光区域积分(FRI)分析表明,类蛋白质占总标准体积60%~70%,进一步表明蛋白质为水体有机物的主要成分;膜孔径越小,类腐殖酸含量越高,腐殖化程度越高。     

便携式X荧光分析仪快速测定土壤中Cd· Hg· As· Pb· Cr含量

[目的]探索便携式X荧光分析仪应用于环境应急监测中的可行性。[方法]采用X荧光分析法选择《土壤环境质量标准》(GB15618—1995)中重点监测的Cd、Hg、As、Pb、Cr进行标准样品分析,进行现场实测与实验室样品分析,研究该方法测定这5种重金属的准确度和精密度。[结果]X荧光分析法测定土壤标准物质的相对标准偏差(RSD)为1.77%~22.90%。现场样品实测相对偏差(RD)为-42.00%~18.10%,其中Cr的RD较小,为-21.20%~10.50%;As的RD较大,为-42.00%~18.10%。[结论]便携式X荧光分析仪在土壤重金属环境应急监测中具有一定指导作用。