RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对Gen Bank中公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株(He BHH1/95)为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交的特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株(SM)接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5—6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示:8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10—24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi达到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。     

欧洲现代农业发展现状及启示

英国、丹麦都是欧盟成员国,是典型现代农业的代表,在农业政策支持、环境保护、机械化生产等方面体现了发达国家农业生产技术和管理的基本特点,对正由传统农业向现代农业转型的中国农业和军队农副业生产发展都具借鉴意义.     

飞机草各组分的化感作用研究

化感作用在生物入侵过程中具有重要的意义,飞机草具有化感作用,为研究其入侵性,实验对飞机草的各组分进行生物化感测定。结果表明,飞机草中的化感物质主要存在于石油醚和氯仿俩组分,对萝卜和菜心试验作物的幼苗生长有明显的抑制作用,而且抑制作用随着浓度的提高而增强,尤其体现在对作物的根长抑制上,在浓度2mg/ml时抑制率就达到80%,在4mg/ml时抑制率达到90%。2mg/ml水提物组分则是起到略微促进生长作用。     

粤北大宝山矿区污染成因与源头控制技术应用进展

韶关大宝山矿区周边兴起的无序民采和商业矿采活动对山体周边生态环境造成了巨大的破坏,严重威胁到当地居民的生命健康。为应对矿山生态退化、重金属污染及潜在生态环境等问题,矿区有效实施了水体治理和矿山生态环境修复等多项工程。本文在全面调研和搜集大宝山矿区污染现状相关资料的基础上,以清污分流、尾矿清淤、污水处理、植被恢复、矿山环境综合治理等工程实施内容及相关政策为依据,对大宝山矿区部分污染修复工程案例进行总结。并在全面分析矿山污染来源、横石河及其周边农田土壤、地下水的污染现状的基础上,简要归纳矿区目前所施行的治理工程及其成效,主要包括新山片区历史遗留矿山生态修复工程、铁龙新山片区清污分流工程、李屋拦泥库清淤工程以及尾矿库外排水处理厂工程。大宝山矿区采取的相关治理方法和理念可以为其他矿区的生态修复提供参考。     

莲子机械自动去芯自适应定心技术与样机试验

针对莲子在自动化去芯过程中的钻偏问题,提出了莲子自适应定心方法,该方法基于一种由曲柄滑块机构与平行四边形机构组合而成的自适应定心装置,能实现去芯钻头位置随莲子大小变化而自动调整。利用随机优化算法对机构中的连杆参数进行了优化,实现去芯钻头轴线保持与莲子轴线同轴,理论定心偏差为0.0448 mm。研制了一种自适应莲子去芯机,进行了未分级莲子的去芯试验,结果表明:自适应莲子去芯机钻正率达91.25%,远高于现有去芯设备,初步验证了自适应定心方法的有效性与实用性。研究结果为莲子优质钻芯设备设计、与莲子形状类似物料的优质钻孔设备研发提供参考。     

欧洲现代农业发展现状及启示

英国、丹麦同属欧盟,是典型现代农业的代表,在农业政策支持、环境保护、机械化生产等方面体现了发达国家农业生产技术和管理的基本特点,对正由传统农业向现代农业转型的中国农业和军队农副业生产发展都具借鉴意义.     

猪瘟病毒感染仔猪接种猪瘟疫苗后抗原的跟踪检测

为了解猪瘟病毒感染仔猪免疫猪瘟疫苗后带毒情况,并比较实验室几种猪瘟抗原检测方法的适用性,采用(CSFV)RT-nPCR、猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR(HCLV-FQ-PCR)和CSFV实时荧光定量RT-PCR(CSFV-FQ-PCR)3种检测方法对田间感染CSFV仔猪疫苗免疫前后带毒情况进行定期跟踪检测.结果显示:本实验室建立的CSFV-FQ-PCR灵敏度高于CSFV-RT-nPCR;猪瘟疫苗免疫48 d后,采用HCLV-FQ-PCR方法检测不到血液中的HCLV;猪瘟病毒感染猪免疫疫苗后仍存在持续带毒现象,因此对猪瘟病毒感染猪必须彻底淘汰.     

国内部分猪瘟病毒流行株抗原性分析

为分析我国猪瘟病毒(CSFV)流行株的抗原性差异及其与特异性单克隆抗体(MAb)反应性之间的关系,本研究采用CSFV强弱毒鉴别MAb通过ELISA方法对我国流行的29株分离株进行抗原反应性研究,结果显示针对弱毒株MAb(MAb11)除3株为阳性外,其余均为阴性;而这些分离株可以被强毒MAb(MAb56)分为强反应和弱反应两组。同时对29株分离株E2基因的190 nt进行同源性分析,并将其分为3个亚群,即1.1、2.1和2.2;氨基酸序列具有一致独特的位点差异规律,强反应组(761G、764L)和弱反应组(761R或K、764P)分别具有2个独特的差异位点。推测761G和764L是针对MAb56与CSFV抗原结合的关键位点。     

流行性2型PRRSV强毒株的广谱中和抗体研究

<正>由于疫苗需要提供有效的交叉保护力对抗变异较大的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株,获得可预测PRRSV免疫保护力的评估指标可促进群体管理改善和疫苗研发项目的开展。中和抗体在动物和人的抗病毒免疫中起着关键作用,故通过特异性抗体中和病毒感染性的中和效力是免疫保护     

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验 替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应（不合格）样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应（合格品）样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。