不同水分环境下玉米叶面积QTL定位及候选基因分析

玉米叶面积的大小及分布特征不仅影响其光合效率、蒸腾速率,而且与其耐旱性、耐密性、抗倒伏性及产量形成紧密相关。深入剖析不同水旱环境下玉米不同生育时期不同叶位叶面积的分子遗传机理对玉米耐旱高产新品种的选育具有重要意义。本研究以构建的2套F_2∶3群体为试材,在8种水分环境下,采用复合区间作图法（CIM）和基于混合线性模型的复合区间作图法（MCIM）对玉米相应叶（V₁₈时期第10片叶、R₁时期穗三叶）叶面积进行单环境和多环境联合QTL分析;参考玉米基因组B73 RefGen_v3挖掘稳定表达的QTLs （sQTLs）区间内的候选基因,并对其进行功能分析。结果表明,采用CIM法,单环境下2个生育时期2套F_2∶3群体间总共定位到了7个玉米相应叶叶面积QTLs,主要受显性（81.0%）、部分显性（14.3%）和超显性（4.7%）等遗传效应的调控,其中在干旱环境下定位到了5个QTLs。采用MCIM法,在2套F_2∶3群体间总共检测到6个相应叶叶面积的联合QTLs,其中1个表现为显著的QTL与环境的互作（QTL×E, Bin 2.08~2.09）,1对QTLs （Bin 1.08~1.10与 Bin 2.08~2.09）参与了显著的加性与加性（AA）上位性互作。结合CIM和MCIM法进一步分析在2套F_2∶3群体间检测到了6个sQTLs,其分别位于Bin 1.08~1.10、Bin 2.08~2.09、Bin 4.08~4.09、Bin 6.05、Bin 8.03和Bin 10.03处,并在这些sQTLs区间内确定了12个玉米叶发育相关候选基因。采用生物信息学,总共收集了75个玉米叶发育相关候选基因,通过系统进化树分析表明,这些候选基因划分为3大进化分支,且上述检测到的12个候选基因分布于这3大进化分支上。这些结果为系统地解析玉米不同生育时期不同水旱环境下相应叶叶面积的分子遗传机理提供理论依据,检测到的sQTLs可作为叶面积改良的重要染色体区段,检测到的候选基因为其进一步克隆、功能分析及育种应用提供了信息参考。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

云南省某腹泻仔猪群猪流行性腹泻病毒核酸检测及其N基因序列分析

猪流行性腹泻是猪场新生仔猪腹泻的主要病原之一。为确定云南省曲靖市某猪场新生仔猪出现呕吐、腹泻和高死亡率的病因,采集病死仔猪肠道、肠系膜淋巴结、脾脏等组织病料,处理后提取病原核酸,通过RT-PCR进行导致仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原核酸检测。结果显示,仅PEDV核酸阳性,其他病原均为阴性。对检出的PEDV阳性样品N基因进行序列分析发现：阳性样品N基因与河北的T10-HB2018毒株核苷酸同源性最高,为99.7%;与疫苗株AJ1102和LW/L毒株核苷酸同源性为97.4%~97.5%,在同一个分支上,均属于基因II群;与经典毒株CV777株核苷酸同源性略低,为95.7%。结果表明,引起该仔猪群腹泻的主要病因为PEDV感染,流行毒株未发生变异,当前疫苗对其防控有效。依据分析结果,该场采取PEDV疫苗紧急免疫,使疫情得到有效控制。本研究对于指导该地区猪群腹泻病防控具有参考意义。     

云南省野猪源猪瘟病毒E2及5'NTR基因序列测定分析

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重危害我国养猪业健康稳定发展。本研究采用RT-PCR方法,对从云南省宁洱县2头病死野猪体内分离到的2株CSFV毒株进行了E2及5''NTR基因扩增、克隆及序列测定;采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件,对测得的序列与国内外参考毒株进行了同源性分析及系统发育分析。结果显示：2株野猪源CSFV株E2、5''NTR基因同源性分别为87.2%、100%,与国内外参考毒株同源性分别为81.0%~97.6%、93.6%~98.5%,与我国强毒株Shimen株的同源性分别为81.0%~81.2%、95.6%;2株野猪源CSFV毒株E2基因属于基因2.1亚型,5''NTR基因属于基因2.3亚型。氨基酸序列分析显示：其中一株分离毒株的E2基因有6个氨基酸具有2.1d分子变异特征,另一株兼有2.1d和2.1b亚型分支特征,可能是2.1b和2.1d亚型的过渡毒株。结果表明,云南省野猪源CSFV虽存在一定的遗传衍化,但总体比较稳定。本研究为云南省CSF防控提供了分子流行病学依据,为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。     

全球基因I型非洲猪瘟病毒流行与疫苗研究进展

非洲猪瘟病毒已在我国定殖并形成较大污染面,国内样品中发现基因I型非洲猪瘟病毒,提示当前临床中实际流行的病毒种群更加复杂。基因I型毒株从1957年传入葡萄牙后,研究人员就开始对其进行研究。多年来,国外对基因I型毒株的流行分布情况特别是弱毒疫苗进行了大量研究,但国内目前尚无这方面的分析讨论。为此,作者就基因I型非洲猪瘟病毒流行与疫苗研究现状进行综述,以期为我国非洲猪瘟的科学防控提供参考。     

豚鼠气单胞菌引起山羊猝死的鉴定

2020年5月,江苏省某养殖场饲养的220只山羊疑似感染产气荚膜梭菌,共死亡25只。为鉴定感染的产气荚膜梭菌复合群类型,采集大肠、小肠内容物以及肠系膜淋巴结、肝、脾、肾等组织病料进行细菌分离鉴定,并对分离菌株进行药敏试验及致病性试验。结果显示：分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,经生化试验和16S rRNA试验鉴定为豚鼠气单胞菌;该分离株对多种常用抗菌药物耐药,仅对呋喃唑酮敏感;该菌能造成小鼠发病死亡。此次从临床发病羊病料中分离到致病性豚鼠气单胞菌,在国内较为少见,截至目前未见类似报道,本研究为避免此类疫病的临床误诊以及做好该病防控提供了帮助。     

应用液态悬浮芯片技术建立17种大肠杆菌耐药基因多重快速检测方法

为建立一种快速、高通量的多重耐药基因检测方法,利用Luminex液态芯片平台,建立了可同时检测17种耐药基因的液态芯片检测方法。该方法对大肠杆菌常见的七大类抗菌药物所对应的17种耐药基因（blaSHV、blaCMY-1、Aph3-IIa-1、aac(6)-Ib-cr、aadA-1、cmlA-1、gyrA、mcr-1、NDM-1、parC、qnrS-1、sul-1、sul-2、sul-3、tetA、tetB、tetX）进行序列分析,随后依次对其设计多重PCR特异性引物,构建特异的阳性质粒作为阳性参比品进行液态芯片检测条件优化,从而进行多重耐药基因液态芯片检测方法的研发。结果显示：成功构建了17种耐药基因的阳性质粒,并建立了两套体系用于检测17种耐药基因。在特异性试验中,两套体系中的检测信号无干扰,具有较高的特异性数值;敏感性试验中,体系一的单一质粒最低检测量为102~104 copies/μL,混合质粒为103~105 copies/μL;体系二的单一质粒最低检测量为102~105 copies/μL,混合质粒为104~106 copies/μL;有效性试验中,液态芯片法与PCR检测结果的Kappa值多在0.60以上,具有高度一致性。结果表明,本研究建立的2套液态芯片检测体系具有高通量、高灵敏和高特异性的优点,可同时对17种耐药基因进行检测,能够达到快速检测的目的。     

南荻MlNAC2基因差异表达与耐盐生理响应的相关性分析

为探究南荻（Miscanthus lutarioriparius）耐盐生理及其与基因表达的相关性,采用0%,0.2%,0.5%,0.8%浓度的NaCl处理奇岗和不同基因型南荻,测量NaCl溶液胁迫下的MlNAC2基因相对表达量和6个耐盐指标,并对二者之间的相关性进行分析。结果显示,南荻MlNAC2基因的表达量变化在不同材料之间差异较大,L2,L6,L9,P1出现10倍以上增加,而L1,L5,L8,L10变化量都在3倍以内。生理指标中叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、脯氨酸与无胁迫对照相比均差异显著;丙二醛、超氧化物歧化酶在部分材料中与对照相比无显著差异。相关性分析表明,与MlNAC2基因的表达量变化最相关的生理指标是一系列光合作用相关因子：叶绿素含量、净光合速率、气孔导度。本研究结果可为探究南荻耐盐生理响应与分子机理层面的相互关系提供借鉴。     

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。     

细菌β-内酰胺酶和氨基糖苷磷酸转移酶耐药基因可视化LAMP检测方法的建立和初步应用

为了建立快速准确检测微生物携带氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因的环介导等温扩增(LAMP)方法,根据抗性基因β-内酰胺酶(bla)和氨基糖苷磷酸转移酶(Aph)基因序列,利用Primer Explo-rer V4在线工具设计特异LAMP引物,成功建立了检测上述2个基因的可视化LAMP方法。该LAMP体系在65℃条件下反应1 h,以100μmol/L HNB为最佳浓度,可实现阳性结果的准确判读,bla基因的检测灵敏度达到1 pg/μL。应用该LAMP方法成功检测到污水环境的微生物携带bla抗性基因。建立的LAMP方法在快速、可视化检测环境中抗性基因方面具有潜在应用价值。