猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH－1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30的多克隆位点中，经鉴定后得到重组质粒pET30a-N，将此重组质粒转化到受体菌BL21中，用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS－PAGE、Western-blot分析，并以此为包被抗原进行ELISA检测，结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，4小时后表达可达到高峰，其大小约为23kD，薄层扫描结果表明庐蛋白表达量约占菌体蛋白总量的32％，该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应，而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别，证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBond^TM纯化系统进行纯化，其纯度可达到91％，纯化后的蛋白以50μg/孔包被96孔板，检测来自不同地区送检的猪血清，同时以全病毒ELISA为对照，结果发现二者的符合率高达93．3％，而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感，且背景低，制备过程简单，这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。     

畜禽基因工程疫苗及诊断技术产业发展现状与前景

改革开放二十多年来，我国规模化养殖业发展迅速，畜禽的饲养量居世界首位，在国民经济中发挥的作用日益明显。但与发达国家相比还有很大差距．这种差距主要表现为我国畜牧业的生产效率低，成本高。导致效率低的主要原因是传染性疾病的流行使幼畜、禽的成活率低。20世纪80年代以来，新发生或传人我国的动物疫病多达34种，严重威胁着畜牧业生产和畜产品安全，影响着我国畜产品在国际市场上的信誉，也间接地影响了我国对外贸易及旅游业。随着规模化养殖业的发展，     

应用生物素标记的重组质粒作为探针的杂交条件及敏感性研究

貂肠炎细小病毒复制中间型 DNA(MEV-RF-DNA)的 HindⅢ-C 片段被克隆到 pBR322中形成重组质粒pBM。用光生物素(photo biotin)标记 pBM 和 HindⅣ酶切片段的 pBM 作为探针分别与貂,太细小病毒感染的细胞培养物人工感染细小病毒的貂和犬粪便进行斑点杂交试验,结果发现两种探针检测的敏感性相差10倍以上.光生物素标记的完整重组质粒探针具有放大作用,酶切后的 pBM 敏感性不如前者.另外,本实验还证明在用生物素标记的探针杂交时,被检样品用热变性处理比碱变性处理效果更佳,而且简便。     

鸡Th1样淋巴因子mRNA的体外表达

应用RT－PCR技术研究了鸡脾细胞在体外受到丝分裂原ConA的刺激后，其Th1样淋巴因子的体外表达动态，结果表明，鸡脾细胸在ConA诱导培养1，2，3，4，8，12，24h后，均表达a-干扰素mRNA,且未经有丝分裂原刺激的脾细胞以及诱导但培养了3，8，48h的脾细胞，也表达a-干扰 素mRNA,r-干扰素在上述诱导培养时，其mRNA均发生表达，未经有丝分裂原刺激的脾细胞培养3，8h时，也表达r-干扰素mRNA, 但培养48h时则未检测到，未受有丝分裂原刺激的细胞不表达r－干扰素mRNA，鸡白细胞介质－2mRNA仅在刺激2，3，4，8，12，24，48h时表达，在其他情况下则未检测到，本研究还发现1种与已报道的鸡a-干扰素序列不同的基因，但基体外的表达动态类似于鸡a-干扰素，上述研究表明，鸡Th1样淋巴子的体外表达类似于哺乳动物，但也存在一定的差异。     

牛疱疹病毒1型洛精株gD基因的分子克隆及序列分析

根据已发表的牛疱疹病毒1型（BHV－1）P8－2株gD基因的核苷酸序列设计了1对特异性引物，对我国BHV－1洛株gD基因进行PCR扩增，并对其克隆，测序和分析，结果表明，gD基因的核苷酸长度为1251bp，其编码417个氨基酸，BHV－1洛精株gD与国外报道的P8－2株的gD基因的核苷酸的同源性高达99．92％，氨基酸的同源性高达100％，这说明BHV－1的gD糖蛋白高度保守。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-la株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因（ORF1）和非编码区分别进行了克隆和测序，并对其基因特征作了分析。结果表明，CH-1a株ORF1全长11882nt，其中ORF1a长7512nt、ORF1b长4374nt。它们与VR2332株的核苷酸同源性分别为89%、92%；与LV株的核苷酸同源性分别为54%、63.3%。ORF1编码两个聚合蛋白，其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生6个成熟的非结构蛋白（Nsp1α、Nsp1β、Nsp2-5)，以Nsp2的变异性最为显著，它与LV株的氨基酸同源性为41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后，产生4个成熟的非结构蛋白（RdRp,CP2-4)，其中RdRp为病毒的复制酶，CP4表现出较大的变异性，与LV株的氨基酸同源性为48%。在ORF1a-ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构，它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区，其中5'NCR长190nt，比LV株5'NCR短31nt，其核苷酸同源性为61%。3'NCR长151nt，比LV株3'NCR长37nt，保守性稍高，其与VR2332株和LV株的核苷酸同源性分别为95.4%和78.2%。在3'NCR末端有一个poly(A)尾巴，长20nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列，是复制酶识别并结合的区域。本研究进一步证实CH-1a株在基因型上属于北美洲型。     

鸡IL-2在新城疫病毒F基因疫苗免疫中的作用

利用国内首次克隆成功的鸡 IL- 2基因真核表达质粒与新城疫病毒 (NDV) D2 6株 F基因真核质粒 (F基因疫苗 )联合免疫 SPF雏鸡 ,观察了其诱导的免疫应答及免疫保护作用 ,以及不同免疫方式对其免疫作用的影响。结果证实了国内克隆鸡 IL- 2基因的免疫增强作用 ,以及作为免疫佐剂应用于禽类基因免疫的可行性 ,为鸡 IL- 2这一新型佐剂的实际应用提供了重要的试验依据。     

表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建

病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。     

猪病研究新进展——IPVS2002会议简报(二)

5 猪瘟 Dewulf等证实猪瘟病毒感染早期通过排泄物传播病毒并不重要,提示机械传播在猪瘟病毒并不具有流行病学意义.鉴于弱毒疫苗缺乏可鉴别的遗传标记,有的国家已禁止使用弱毒疫苗,Marowska-Daniel用去掉跨膜区加上人CD33的信号肽的GP55基因构建了基因疫苗,接种猪可诱导对猪瘟的免疫保护.Dewuff等评价了猪瘟病毒E2亚单位疫苗的免疫效力,接种后7d攻毒所有猪发病,出现病毒血症,部分猪死亡,这与以往的报道有所不同.研究表明摄入初乳的新生仔猪接种猪瘟疫苗不能诱导足够的免疫保护,提示母源抗体对疫苗接种具有干扰作用.