从台湾地区进口甲鱼蛋传入疫病的风险评估

近年来,随着海峡两岸贸易的增长,来自台湾地区的甲鱼蛋输入量猛增。为了在促进两岸贸易的同时,防止有害生物传入,保护大陆地区养殖业安全和人民健康,根据世界贸易组织SPS协定的有关原则,对从台湾地区输入的甲鱼蛋携带的霍乱弧菌等10种细菌和甲鱼虹彩病毒等8种病毒进行了风险分析。评估结果表明:从台湾地区输入甲鱼蛋的主要风险是蛋表面在自然条件下可能被病原性微生物,如细菌和病毒等污染。这些病原可能会随着甲鱼蛋传播到大陆地区,造成疾病流行,或者危害人类健康。虽然其风险不高,但一旦传入,会造成一定的负面影响,其中有些病原也会引起严重后果,因而必须进行适当监管。监管重点是控制蛋表面污染的微生物。基于风险评估,本研究提出了3个风险管理备选方案。     

霍乱弧菌DPO-PCR特异性检测方法的建立与应用

采用一种新型的引物设计方法——双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）,以霍乱弧菌mdh基因为靶序列,建立了霍乱弧菌DPO-PCR特异性检测方法,分析了DPO引物退火温度不敏感性、检测灵敏度及特异性,并对检测方法进行了初步应用。灵敏度结果显示,DPO-PCR方法对霍乱弧菌的最低检出限为1.07×10^2 CFU/mL。退火温度不敏感性试验中,与常规PCR引物相比,DPO引物在45～65℃退火温度均能够高效扩增出靶基因片段。特异性结果显示,DPO-PCR方法的特异性比常规PCR方法强,不产生任何非特异性扩增。利用建立的霍乱弧菌DPO-PCR检测方法对采集的550份样本进行检测,检出43份霍乱弧菌阳性样本,经行业标准法（SN/T2425-2010）复检,检测结果相同,表明所建立的DPO-PCR检测方法具有良好的实用性,为霍乱弧菌的快速准确检测提供了新途径。     

1株鸭源非O1/O139群霍乱弧菌的分离鉴定与致病性分析

为探明引起贵州省某鸭场雏鸭发病的病原及其致病性和耐药情况，本研究对该鸭场送的疑似细菌感染病鸭进行剖检，取鼻黏膜、心脏和肝脏等组织器官接种于培养基中进行细菌分离鉴定，通过对分离菌进行药敏试验、动物回归试验和毒力基因检测研究其耐药情况和致病性。结果显示，分离菌在血琼脂培养基上生长16 h后呈现为边缘整齐、有光泽的乳白色菌落，伴有β-溶血现象，经革兰氏染色后在生物显微镜下呈两端钝圆、弧状、排列无规则的革兰氏阴性短小杆菌，与霍乱弧菌相符；16S rDNA基因序列同源性及系统进化树显示，该分离菌与霍乱弧菌同源性高达99.6%~99.7%聚为一支；药敏试验结果显示，分离菌对大部分药物都表现为耐药，其中对氨苄西林、克林霉素、复方新诺明、苯唑西林和克林霉素等抗菌药耐药性较强，对头孢哌酮和头孢曲松敏感；动物回归试验显示，分离菌可导致试验组雏鸭5 d内全部发病死亡，表明该分离菌对雏鸭具有较强的致病性；毒力基因PCR检测结果显示，检测的霍乱弧菌相关毒力基因hlyA、ompW和chxA为阳性，而检测的O1群rfb、O139群rfb、tcpA及ctxA基因为阴性，表明本次分离的霍乱弧菌携带有致病基因，但不属于O1和O139血清群。结果表明，该鸭场雏鸭发病的疫情病原为非O1/O139血清群霍乱弧菌，该菌致病性强且对多种抗菌药物耐药。本试验结果为贵州省鸭霍乱弧菌病的防控提供了参考依据。     

北京港口水产品中非O1/O139群霍乱弧菌MLST分型研究

为了分析2008-2011年北京港口进出口水产品中非O1/O139群霍乱弧菌的多位点序列分型(MLST)特征,为霍乱弧菌导致食品安全事件的有效溯源提供理论支持,选取2008-2011年北京港口食源性非O1/O139群霍乱弧菌分离株67株,采用毒力基因PCR检测并用MLST分析。结果:毒力基因PCR检测结果显示,所有菌株均未检出CTX、tox R、hly A 3种基因。菌株的MLST结果显示,菌株可被分为62个ST型,具有明显的多样性。其中原有STs 2个,新发现STs 60个。同ST型菌株均来源于同一国家,本实验数据同pubmlst数据库中数据进行分析,有7个STs可以归为7个克隆组,它们来源于中国和泰国,同组内STs来源于中国、澳洲、法国、泰国和非洲。表明北京港口非O1/O139群霍乱弧菌遗传特征复杂多样,MLST方法可作为可靠的食品污染溯源手段,相同地区的菌株有一定的地域特点,此研究丰富了现有霍乱弧菌MLST数据库,为其溯源提供支持。     

浙江省舟山地区水产品及其养殖环境中霍乱弧菌污染状况调查

为了解浙江省舟山地区水产养殖环境及水产品中霍乱弧菌的污染状况,于2007年与2009年采集水样、泥样及多种水产品等176份样品。用TCBS选择性培养基从样品中分离弧菌,并应用基于编码胶原酶的霍乱弧菌看家基因(vcc)的特异性PCR方法检测霍乱弧菌。霍乱弧菌的总检出率为5.1%(9/176),其中2007年的检出率(5.5%)稍高于2009年(4.5%)。9株霍乱弧菌分离株中,5株来自环境,4株来自水产品。虾类产品中检出3株,而检出这3株霍乱弧菌的虾类产品均为南美白对虾。由此可见,水产品及其养殖加工环境存在安全隐患。     

天津市水产养殖动物霍乱弧菌携带情况调查

从2008年4月至11月,对天津市11种水产养殖动物进行霍乱弧菌检验,共取得样品211份,其中携带霍乱弧菌的样品36份,检出率为17.1%,经血清凝集试验证明都为非O1霍乱弧菌。在11种水产养殖动物中,以南美白对虾霍乱弧菌的检出率最高,为25.0%;鲤鱼和金鱼次之,分别为7.7%和5.3%;其他8种水产养殖动物中未检出霍乱弧菌。     

副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。     

早醒甲鱼快处理

立春至4月,气温回升,在晴天往往会发现甲鱼池中部分甲鱼已经苏醒,爬出晒太阳。如果此时池中水温尚未达到16℃,这些甲鱼行动迟缓,那么这些甲鱼就是患重病的甲鱼,这种苏醒是属于非正常的苏醒。非正常苏醒的甲鱼,有80%～90%会死亡,必须及时处理掉。因为此时温度低,仍是甲鱼休眠期,这些非正常苏醒的甲鱼不能进行正常的新陈代谢,且免疫能力极其微弱,即使进行药物治疗,治愈的可能性很小,大部分患病甲鱼仍会死亡,得不偿失。非正常苏醒死亡的甲鱼是不可食用的,但患病未死的甲鱼却可食用,一般不会影响人体健康。所以,甲鱼饲养户如果发现甲鱼非正常苏…     

霍乱弧菌及肠出血性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

针对霍乱弧菌肠毒素和肠出血性大肠杆菌志贺毒素基因（ctx、stx1和stx2）设计引物,扩增大小不同的特异性片段,优化反应条件,建立多重PCR方法,对人工污染的水样品进行模拟检测。结果显示,多重PCR扩增系统针对目的菌具有高度的特异性。敏感性试验证实,当多重PCR反应体系中模板含量在10CFU时仍能检出。模拟水样品多重PCR检测的敏感性试验证明,人工污染的河水直接集菌检测敏感性为100～1 000CFU/mL,增菌培养后多重PCR检测敏感性可达1CFU/mL。本试验于同一PCR体系检测霍乱弧菌和肠出血性大肠杆菌的毒素基因,可用于这2种致腹泻性病原菌的快速检测。     

我国甲鱼养殖现状及展望

我国甲鱼养殖现状及展望籍小琴（山西农业大学图书馆）甲鱼的营养保健价值为世人认可，许多国家都在进行甲鱼保健食品的研制和开发。养殖甲鱼的经济效益也颇为可观，是农民致富的又一新途径。一、甲鱼的营养保健作用及生产状况甲鱼只名圆鱼、鳖，属中华鳖科，学名中华鳖，...     

泰国进口鳄鱼霍乱弧菌药敏试验

在某鳄鱼养殖场抽检的60份泰国进口鳄鱼肛拭子样品中,有12份检出霍乱弧菌。通过生化试验和血清学分型等鉴定,确认12株霍乱弧菌均为非O₁非O₁₃₉群霍乱弧菌。采用18种抗菌药物进行药敏试验,结果显示所有菌株对大多数抗菌药物高度敏感,对四环素等药物中度敏感,对氨苄青霉素和氧呱嗪青霉素不敏感。     

北海近岸养殖海域3种弧菌的分离鉴定及耐药性分析

对北海近岸养殖海域的3种弧菌(Vibrio)进行了分离鉴定,并对鉴定的弧菌进行耐药性分析。通过从北海近岸养殖海域随机采集水样,利用TCBS培养基对所采水样进行弧菌的分离和纯化,采用PCR方法和序列分析对弧菌进行鉴定,并对鉴定出的3种弧菌进行了常用抗菌药物耐药性的检测。共分离获得67株疑似弧菌菌株,经鉴定,19株为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),4株为霍乱弧菌(Vibrio cholera),4株为河流弧菌(Vibrio fluvialis)。耐药性分析研究表明,19株副溶血性弧菌总体显示对10种常用抗菌药物具有耐药性,其中100%的菌株对四环素、卡那霉素和红霉素表现耐药,94.7%的菌株对氨苄西林耐药、84.1%的菌株对左氧氟沙星和78.9%的菌株对环丙沙星耐药;4株霍乱弧菌和4株河流弧菌对10种抗菌药物的耐药性均较强,但敏感度低,两者对复方新诺明均表现为中介敏感。本研究提示,北海近岸养殖海域中弧菌种类较多,其中以副溶血性弧菌为主,大多对常用抗菌药物具有耐药性,对北海近岸海水养殖疾病防治具有一定的指导意义。     

不同饲料对种鳖繁殖效果的影响及甲鱼卵的营养成分分析

试验从饲料因素影响甲鱼的人工繁殖效果出发,从营养的角度初步探讨了不同饲料的营养价值。同时测定了甲鱼卵的营养成分,通过与禽类蛋比较分析,评定了甲鱼卵的营养价值,也从甲鱼卵的常规营养成分及微量元素等方面的反馈信息来指导种鳖的饲料成分的配制,以求达到更加适宜的营养配给,从而提高甲鱼的产卵率和受精率。     

副溶血弧菌和溶藻弧菌双重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时快速检测海产品中的副溶血弧菌(VP)和溶藻弧菌(VA)的双重PCR方法,本研究根据VP和VA的toxR基因序列设计针对这两种细菌的两对特异性引物,建立能够快速同时检测这两种细菌的双重PCR方法,并对该反应体系的特异性和灵敏度进行检测。结果显示纯培养细菌VP和VA的检测灵敏度分别为2.32×103cfu/mL和2.56×103cfu/mL,临床病料检测灵敏度分别为2 cfu和3 cfu;与枸橼酸杆菌、沙门氏菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌无交叉反应。研究表明本实验方法操作简便快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,并且经济实惠,值得推广应用。     

Purification and renaturation of membrane neuraminidase from Haemophilus parasuis

Haemophilus parasuis, which causes polyserositis, polysynovitis, meningitis, septicemia, and pneumonia in pigs, has emerged as an increasing problem in modern swine production systems. Co-factors for and the pathogenesis of H. parasuis disease are not defined. One of the potential virulence factors of H. parasuis is its neuraminidase (sialidase). While purifying the H. parasuis neuraminidase from the membrane fraction, we developed a protocol to renature enzymatic activity after enzyme preparations were resolved electrophorectically in denaturing polyacrylamide gels. The H. parasuis neuraminidase co-resolved with recombinant neuraminidase of Vibrio cholera; thus its apparent molecular mass is 82 kilodalton (kDa). The H. parasuis neuraminidase was associated with the membrane fraction and the purification protocol removed over 99% of the H. parasuis cell protein while retaining over 90% of the neuraminidase activity. Purified protein will provide another avenue to clone the neuraminidase gene that has been refractory to cloning and the protocol will be a means to purify recombinant protein.     

实验室人工感染诱发猪瘟野毒垂直传播

利用2头人工感染中等毒力猪瘟野毒耐过猪进行配种,诱发了猪瘟野毒垂直传播.带毒母猪于带毒后171 d产下9头仔猪,其中3头为死胎,6头为木乃伊.直接免疫荧光抗体试验和RT-PCR检测,9头均为阳性.测序结果表明,3头测序仔猪中,2头仔猪所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列与公猪所接种病毒的一致;另1头仔猪所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列与公猪所接种病毒的同源性高于与母猪所接种病毒的同源性.母猪在与公猪配种前后,其所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列发生了变化,配种后与公猪所分离病毒的一致,说明猪瘟病毒在猪体内的繁殖存在一定的优势选择现象.     

纳米金PCR技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用

纳米金PCR是在普通PCR基础上发展起来的新技术,它能够明显提高普通PCR的灵敏度和特异性。根据副溶血弧菌(VP)的toxR基因序列,应用primer6.0设计一对特异性引物,建立了纳米金PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、循环数、特异性和灵敏度进行测定。采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果表明能扩增得到与试验设计相符的208bp(VP)的特异性条带;与溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌没有交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度为3cfu/反应体系。与普通PCR法进行比较,该方法检测灵敏度比普通PCR高10倍。经临床检测,从150份带鱼、鱿鱼和鱼粉中检出5份阳性样品,与常规细菌分离鉴定方法符合率100%。该试验方法的建立对于加强进出口水产品中VP的检验检疫具有十分重要的意义。     

Vaccination of Pigs Against Hog Cholera (Classical Swine Fever) With a Detergent Split Vaccine

Four pigs were inoculated subcutaneously with a detergent (triton X 100) split hog cholera virus in Freund’s incomplete adjuvant. Four other pigs were in the same way inoculated with a detergent split bovine viral diarrhoea virus, also in Freund’s incomplete adjuvant. In the experiment were used 3 control pigs. The vaccinations were repeated after 3 weeks. All pigs were challenged with highly virulent hog cholera virus (Tübingen) 12 weeks after primary inoculations. Signs of hog cholera were only noted in the control pigs.This introductory experiment was succeeded by a larger experiment with subcutaneous inoculations of: 10 pigs with detergent split hog cholera virus in Freund’s incomplete adjuvant, 10 pigs with detergent split hog cholera virus in a saponin (Quil A) solution, 10 pigs with detergent split bovine viral diarrhoea virus in Freund’s incomplete adjuvant, 10 pigs with detergent split bovine viral diarrhoea virus in the Quil A solution plus 5 control pigs. The vaccinations were repeated after 3 weeks, and finally all pigs were challenged 9 weeks later with the highly virulent hog cholera virus strain.With the exception of 1 animal which died accidentally, all animals survived in the groups inoculated with the Quil A vaccines and in the group inoculated with the detergent split hog cholera virus/oil adjuvant vaccine. In the group inoculated with the detergent split bovine viral diarrhoea virus/oil adjuvant vaccine, some of the pigs died of hog cholera.     

实时荧光PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的研究

目的建立快速检测水产品中副溶血性弧茵的实时荧光PCR方法。方法利用副溶血性孤菌TDH基因的保守序列设计引物和探针,建立快速检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法。结果本研究建立的检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法,其纯茵检测低限低于10cfu/PCR反应体系;对模拟阳性样品直接检测,检测低限为10~3cfu/g。模拟样品经增茵培养4～6h后,检测低限达1cfu/g;用本法对24株标准菌株/参考菌株进行检测,结果除副溶血性弧菌呈阳性外,其他23株非副溶血性弧菌均呈阴性反应;重复性试验结果:批内和批间变异系数均小于1%。结论本研究建立的副溶血性弧菌实时荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异和重复性好的优点,可在8h内对水产品中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测。