抗犬细小病毒纳米抗体的制备及其中和活性鉴定

【目的】 建立抗犬细小病毒（CPV）纳米抗体（Nb）库,从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】 以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区（VH）扩增,与pBSD载体连接,构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测,在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物,将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用pET-27b表达目的蛋白,通过变性、复性手段纯化目的蛋白,用SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。将Nb包被96孔板,采用ELISA法检测Nb对CPV的亲和力。通过病毒微量中和试验检测Nb抑制CPV感染猫肾细胞（F81）的情况。【结果】 PCR扩增结果显示,在384 bp处可见明显条带,与预期大小相符,证明pBSD-Nb库构建成功。细菌展示后,流式细胞术检测结果显示,有9株阳性峰偏移率高的Nb,分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9。PCR扩增9株Nb基因片段,获得384 bp的条带。SDS-PAGE结果显示,在约14 ku处有一条带,说明成功获得纯化蛋白。ELISA检测结果表明,9株Nb中有6株Nb对CPV的亲和力较强。体外病毒中和试验检测发现,1株Nb能够中和病毒,抑制F81细胞病变,中和病毒的有效浓度为0.05 mg/mL。【结论】 本研究成功建立pBSD-Nb库,筛选出6株对CPV具有高亲和力的Nb,并成功获得1株具有中和活性的Nb,为CPV治疗性抗体制剂的开发提供了新的思路。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

噬菌体展示系统的构建及其在疾病防控领域应用研究进展

噬菌体展示技术作为目前应用广泛的展示抗体技术,逐渐成为生产基因工程抗体的重要工具。噬菌体展示技术是以噬菌体或噬菌粒为载体,通过将外源多肽基因整合到噬菌体基因中,以融合表达的形式将外源蛋白展示在噬菌体表面的分子生物学技术。近年来,噬菌体展示技术在抗体筛选领域的应用越来越广泛,与传统制备抗体的方法相比,噬菌体展示技术具有通量高、成本低、操作简单等特点,且通过该技术筛选得到的抗体不仅可在标签蛋白的辅助下进行选择和纯化,还可通过基因测序的方法得到单链抗体的完整基因序列。笔者首先对噬菌体抗体库进行分类,根据抗体的来源将噬菌体抗体库分为天然抗体库和免疫抗体库,通过免疫动物制备的抗体文库的特异性、抗体阳性率明显高于天然抗体文库;其次简述了噬菌体抗体库的构建流程,其中噬菌体表达载体的选择是展示技术的关键,整合了噬菌粒基因的辅助噬菌体侵染其特异性菌株,从而通过抗生素平板对该系统进行选择性筛选;最后讨论了噬菌体展示技术在疾病防控领域应用的研究进展,抗体的首次人源化使同源性抗体在临床上应用成为可能,后续用于预防和治疗病毒性疾病的动物同源性抗体的研发进一步证明了噬菌体展示技术用于生产诊断或潜在治疗试剂的能力。该综述主要聚焦于噬菌体展示系统的构建及其在疾病防控领域的应用,以期对后续通过噬菌体展示技术筛选单链抗体的应用提供指导。     

羊驼免疫库的制备及抗孔雀石绿纳米抗体的筛选

孔雀石绿（malachite green,MG）是一种易溶于水和乙醇等的基础染料,可在多种行业应用,并曾用于水生动物多种疾病如真菌病、寄生虫病、细菌性疾病等的治疗。但因其具有致癌等毒副作用,目前已被禁用。然而市场上仍有在水产品违法使用MG的现象,因此需要加强对该药品残留的检测。本研究选择羊驼免疫库筛选抗MG纳米抗体,通过噬菌体ELISA筛选高亲和力和特异性的纳米抗体。通过辅助噬菌体M13的救援,使得纳米抗体基因（VHH）与噬菌体外壳蛋白基因融合表达,从而使得VHH蛋白展示在噬菌体表面,通过有限稀释筛选和多次洗脱的办法,获得含有目的基因的单个噬菌克隆;将重组质粒PMES4-VHH转化到表达细胞中,进行体外表达。最后采用NI-NTA柱进行His标签纯化,得到抗MG纳米抗体,并进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示：噬菌体文库成功构建,库容为3.2×108 cfu/mL;通过ELISA筛选,得到16个具有抑制效果的噬菌体克隆,经对噬菌体基因测序并翻译,得到2种氨基酸序列;将重组质粒转化至表达菌株表达、纯化,最后得到大小约为15 kDa的抗MG纳米抗体,从而为MG的下一步检测奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。     

犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies, VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10⁶ CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CP...     

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白纳米抗体的筛选及活性检测

禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交技术对非免疫双峰驼纳米抗体酵母文库进行筛选。随机选择15个用QDO/X/A平板筛选到的纳米抗体(Nanobody or VHH)阳性克隆,经过酵母共转验证、序列测定分析,最终选择在QDO/X/A平板显强阳性且序列正确的8株VHHs在E.coli BL21(DE3)中进行表达、纯化;间接ELISA结果表明,筛选出的8株纳米抗体均与AEV标准抗原具有反应原性,其中2株纳米抗体VHH4、VHH9的活性高于阳性对照。这一结果为AEV的检测与病原研究奠定了一定的基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是猪的一种高度传染性疾病，严重威胁全球养猪业的发展。本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(ASF virus, ASFV)NP419L蛋白的纳米抗体并对其在ASF抗体检测中的应用进行初步评价。大肠杆菌表达和Ni-NTA亲和层析纯化等技术表达纯化重组NP419L蛋白；将纯化的重组蛋白免疫双峰驼，5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总RNA,经反转录、巢式PCR、酶切、连接和电转化等构建抗NP419L蛋白的噬菌体展示文库；利用噬菌体展示筛淘技术，经三轮筛淘获得抗NP419L蛋白的纳米抗体；构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白的真核表达载体，转染HEK293T细胞，ELISA和间接免疫荧光(IFA)等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与NP419L蛋白的结合；竞争ELISA初步评价获得的纳米抗体与HRP融合蛋白在ASF抗体检测中的应用。结果显示，成功制备了纯度较高的预期大小为48 ku的重组NP419L蛋白；构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6×10⁸的噬菌体展示文库；筛淘获得了6株抗NP419L蛋白的纳米抗体；分泌表...     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。