抗非洲猪瘟病毒噬菌体展示单克隆抗体的筛选及表达

为构建抗非洲猪瘟病毒(ASFV)噬菌体单链抗体文库,并获得抗ASFV的单链抗体,本试验利用自然感染AS-FV猪的外周血淋巴细胞提取的mRNA,反转录获得cDNA后分别扩增出猪IgG抗体重链和轻链的可变区基因,构建scFv单链抗体后连接至pComb3XSS载体,构建噬菌体抗体展示文库,经过3轮"吸附、洗脱、富集"的筛淘过...     

牛病毒性腹泻病毒NS5A蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

为防控牛病毒性腹泻的流行，淘选得到抗BVDV-NS5A的纳米抗体序列，并探究其结合活性。通过重组质粒pET30a-NS5A诱导表达并纯化蛋白，免疫羊驼，获得重组质粒pCANTAB 5E-VHH,构建了一个初始的抗BVDV-NS5A纳米抗体展示文库。利用3轮固相亲和筛选，对筛选后的单克隆抗体通过ELISA验证其特异性与结合力并测序、分析。构建出具有较好多样性的噬菌体展示文库，测得库容为5.3×10⁷ CFU/mL,插入率73.9%。通过评价和分析显示，得到20株不同氨基酸序列的纳米抗体，其中7株与NS5A蛋白具有较好反应性。针对抗BVDV-NS5A蛋白淘选纳米抗体，并证明得到的纳米抗体有较好的结合力。研究结果有望用于研发BVDV诊断试剂盒、抗BVDV的候选药物，同时也为后续BVDV的致病机制研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

羊驼免疫库的制备及抗孔雀石绿纳米抗体的筛选

孔雀石绿（malachite green,MG）是一种易溶于水和乙醇等的基础染料,可在多种行业应用,并曾用于水生动物多种疾病如真菌病、寄生虫病、细菌性疾病等的治疗。但因其具有致癌等毒副作用,目前已被禁用。然而市场上仍有在水产品违法使用MG的现象,因此需要加强对该药品残留的检测。本研究选择羊驼免疫库筛选抗MG纳米抗体,通过噬菌体ELISA筛选高亲和力和特异性的纳米抗体。通过辅助噬菌体M13的救援,使得纳米抗体基因（VHH）与噬菌体外壳蛋白基因融合表达,从而使得VHH蛋白展示在噬菌体表面,通过有限稀释筛选和多次洗脱的办法,获得含有目的基因的单个噬菌克隆;将重组质粒PMES4-VHH转化到表达细胞中,进行体外表达。最后采用NI-NTA柱进行His标签纯化,得到抗MG纳米抗体,并进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示：噬菌体文库成功构建,库容为3.2×108 cfu/mL;通过ELISA筛选,得到16个具有抑制效果的噬菌体克隆,经对噬菌体基因测序并翻译,得到2种氨基酸序列;将重组质粒转化至表达菌株表达、纯化,最后得到大小约为15 kDa的抗MG纳米抗体,从而为MG的下一步检测奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc-145细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRR...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白，制备相应的多克隆抗体，根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成，随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中，获得重组杆状病毒质粒，再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示，B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应，并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白，B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠，制备小鼠多克隆抗体，经间接ELISA检测，该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。     

犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies, VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10⁶ CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CP...     

非洲猪瘟病毒A137R蛋白多克隆抗体的制备与应用

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高致病性病毒性传染病。为制备兔抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018分离株基因组DNA为模板扩增ASFV A137R基因,将其克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组表达质粒pET-21a-A137R,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,表达的A137R重组蛋白分子质量约15.0 ku,其主要以可溶形式表达。利用HisTrap亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得高纯度的A137R重组蛋白,利用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,经Protein G亲和层析介质纯化后经western blot、间接免疫荧光和免疫共沉淀试验检测结果显示,制备的兔抗ASFV A137R蛋白的多克隆抗体能特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的ASFV Flag-A137R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV A137R蛋白。本研究为进一步探究ASFV A137R蛋白的功能、其在ASFV感染及致病性中的作用和诊断技术研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体是表面表达有单链抗体（Singlechain Fv,ScFv）或抗体Fab段的噬菌体,用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬菌体表面成为噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库.该技术是丝状噬菌体展示（phage display）与抗体组合文库技术相结合而成.其基本路线为用PCR方法扩增抗体全套可变区基因,重组到噬菌体载体中,并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,把Fab段或ScFv表达到噬菌体表面.通过＂吸附-洗脱-扩增＂的富集过程,从中筛选出特异性抗体的可变区基因.     

鸡CD40L基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了研究鸡CD40L作为分子免疫佐剂的免疫原性,试验采用鸡的脾脏细胞克隆鸡CD40L基因,构建表达载体pET28a-cCD40L进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫长耳白兔,获得兔抗鸡CD40L多克隆抗体,用间接ELISA检测多克隆抗体效价,并进行Western-blot检测。结果表明:获得分子质量为26 ku的重组融合蛋白,多克隆抗体效价为1∶12 800;表达的融合蛋白不仅能与鼠抗His克隆抗体发生特异性反应,而且与获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体发生特异性反应。说明鸡CD40L融合蛋白具有较高的反应活性,所获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体具有良好的特异性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。     

非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体，根据HLJ/2018株的I177L序列，设计引物，扩增带有His标签序列的I177L序列，并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中，转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达和切胶纯化后，用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。结果显示，在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下，诱导5 h后，重组MBP-I177L蛋白表达量最高，蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符；重组蛋白以可溶性表达为主；多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示，抗体效价为1∶128 000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。     

抗人红细胞/抗猪瘟病毒双功能单链抗体的制备及功能鉴定

旨在构建检测猪瘟病毒(CSFV)的双功能单链抗体。通过连接肽将抗人红细胞膜H抗原单链抗体基因2E8-ScFv和抗猪瘟病毒单链抗体基因CSFV-ScFv拼接成融合基因,大肠杆菌密码子优化及人工合成后,构建原核表达载体pCzn1-2E8-CSFV,转化BL21(Plyss)进行重组蛋白IPTG的诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,通过间接免疫荧光(IFA)、ELISA和血凝试验,验证重组蛋白双功能活性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式在大肠杆菌中表达,分子质量约为55 kDa。IFA和ELISA结果表明,纯化复性后的重组蛋白与猪瘟病毒具有良好的结合活性;红细胞凝集试验表明,重组蛋白能与人红细胞特异性结合,同时也能与猪瘟病毒发生特异性结合,具有双功能特性。本研究成功表达了抗人红细胞膜H抗原/抗猪瘟病毒双功能单链抗体,为进一步构建猪瘟病毒红细胞凝集试验快速检测方法奠定基础。     

抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10~9 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。