鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究

为克隆鸡Dazl(Deleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能.提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL.采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48 h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况.结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870 bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99％,编码氨基酸完全一致.酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功.转染48 h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949 bp特异条带和59.7 ku的融合蛋白.荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核.     

猪精子发生候选基因PYGO2的分离、表达和亚细胞定位研究

旨在分离猪PYGO2编码区序列，获悉该基因mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征、细胞中的分布和定位，并构建蛋白相互作用网络。本研究首先利用RT-PCR从成年版纳微型猪近交系（BMI）睾丸组织中克隆PYGO2编码区序列；利用生物信息学解析其基因结构并对蛋白质进行多种功能分析，比较多个哺乳动物PYGO2的氨基酸序列同源性，构建系统进化树和蛋白质相互作用网络；然后利用qPCR技术检测PYGO2在15个组织中的mRNA表达情况；最后通过构建pEGFP-C1-PYGO2融合表达载体，转染猪睾丸细胞（ST），确定PYGO2的亚细胞定位。结果表明，PYGO2基因CDS长1 221 bp，编码406个氨基酸（基因和氨基酸号分别为KY644518和AVB77243.1），定位在猪4号染色体；PYGO2蛋白二级结构以无规则卷曲为主，N端和C端均疏水；氨基酸序列同源比对分析表明，猪PYGO2与其他哺乳动物的相似度均大于97%，在进化上高度保守；蛋白互作网络分析显示，猪PYGO2与9个蛋白可能存在相互作用，其中与BCL9蛋白作用最为紧密；qPCR表达分析表明，猪PYGO2在被检的15个组织中均有不同程度表达，在生殖腺中表达相对较高；ST细胞中的亚细胞定位结果表明，PYGO2 mRNA主要分布在细胞核。本研究获得了PYGO2基因的编码序列，蛋白质结构和定位，蛋白质相互作用网络，mRNA多组织表达特征，可为进一步解析该基因在猪精子生成中的分子机制提供参考。     

固始鸡XCL1基因CDS区克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆鸡淋巴细胞趋化因子（lymphotactin,XCL1）基因CDS区并探索其生物学特性。试验以固始鸡胸腺组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术对该基因的CDS区进行扩增和克隆,并通过生物信息学软件进行相关生物信息学分析。结果表明,固始鸡XCL1基因CDS区长294 bp,编码97个氨基酸。相似性分析结果发现,鸡XCL1基因CDS区序列与牛、山羊、绵羊、人、小鼠、猪和大鼠的相似性分别为53.7%、53.0%、52.9%、51.8%、51.1%、50.9%和50.4%。进化树结果表明,鸡作为非哺乳动物,与哺乳动物亲缘关系较远。XCL1蛋白分子式为C₄₉₁H₈₂₂N₁₅₀O₁₃₂S₆,理论等电点为10.95,属于碱性蛋白;分子质量为11.13 ku,脂肪系数为102.37,不稳定系数为51.44,属于不稳定蛋白,半衰期为30 h;具有跨膜结构（第5-27位氨基酸）和信号肽区域（第1-18位氨基酸）,属于亲水性分泌型蛋白。XCL1蛋白存在8个潜在的磷酸化修饰位点和3个潜在的糖基化修饰位点。XCL1蛋白的二级结构由α-螺旋（35.05%）、β-转角（5.15%）、延伸链（26.80%）和无规则卷曲（32.99%）组成,三级结构预测结果与二级结构一致。亚细胞定位分析表明XCL1蛋白主要在细胞外发挥作用;该蛋白有1个位于第31—88氨基酸残基处的SCY保守性结构域;该蛋白能与OXT、PTAFR、GPR132和XCR1等分子形成互作网络。本试验结果为进一步研究鸡XCL1基因功能提供理论参考。     

绵羊SUN2基因生物信息学分析及其在A549细胞中的表达

本研究旨在克隆绵羊SUN2（Sad1 and UNC84 domain containing 2）基因并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测其在A549细胞中的表达。根据绵羊SUN2基因序列（GenBank登录号：XM_015095026.2）设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增并克隆绵羊SUN2基因CDS序列,测序鉴定后对其进行生物信息学分析,并构建pEGFP-C1-SUN2重组质粒。利用脂质体转染方法将pEGFP-C1-SUN2重组质粒转染至A549细胞并检测其表达。结果显示,绵羊SUN2基因CDS区序列全长2 187 bp,编码728个氨基酸,理论分子质量为81.06 ku,分子式为C₃₅₉₃H₅₆₃₉N₁₀₃₁O₁₁₁₀S₁₄,等电点（pI）为6.20,总原子数为11 387,不稳定系数为56.88,属于不稳定蛋白。绵羊SUN2基因序列与山羊、牛、猪、马、家犬、大鼠、小鼠及人的相似性分别为98.9%、97.2%、91.6%、90.6%、87.1%、82.4%、82.1%和86.1%,不同物种间基因相似性较高,进化过程中相对保守。系统进化树分析表明,绵羊SUN2基因与山羊、牛、猪、马和家犬等哺乳动物的遗传距离相对较近,与鸡的遗传距离较远。结构域及跨膜结构域预测显示,绵羊SUN2蛋白含有1个高度保守的SUN结构域,且存在跨膜结构域。信号肽预测显示其不存在信号肽位点,疏水性分析为亲水性蛋白,氨基酸序列二级结构主要为α-螺旋（51.65%）,其余为无规则卷曲（31.46%）、延伸链（12.36%）和β-转角（4.53%）。试验成功构建了绵羊SUN2基因真核表达载体pEGFP-C1-SUN2,将其转染至A549细胞并检测到蛋白表达。本试验结果为绵羊SUN2基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究SUN2基因在绵羊肺腺瘤病中的作用奠定了基础。     

绵羊Lin28基因编码区克隆与序列分析

为研究绵羊Lin28基因的功能,探讨其在绵羊体细胞重编程中的作用,本研究参照GenBank上小鼠、猪、牛和人的Lin28基因mRNA序列的保守区设计简并引物,Trizol法提取100 d左右胎绵羊肠组织总RNA,RT-PCR扩增Lin28基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件DNAMAN、BioEdit和在线软件NCBI BLASTn、PlantsP和ScanProsite等分别进行核苷酸和推导的氨基酸序列比对,构建进化树,分析蛋白功能结构域并推测氨基酸序列的三维结构。结果显示,绵羊CDS区为包括终止密码子在内的630 bp,编码209个氨基酸。同源性分析结果表明,其与爪蟾、斑马鱼、鸡、牛、马、猫、猪、人、大鼠和小鼠的核苷酸序列同源性分别为53.8%、55.2%、70.2%、88.3%、88.7%、89.2%、89.5%、90.5%、95.9%和98.9%;氨基酸序列同源性分别为76.5%、67.9%、93.2%、99.3%、97.7%、99.3%、99.3%、98.5%、99.3%和100.0%。生物信息学分析显示,绵羊Lin28蛋白含有2个CCHC型的锌指结构和1个冷休克结构域。结果表明,本试验成功克隆Lin28基因的编码区,为进一步研究Lin28基因的功能及探讨其在绵羊体细胞重编程中的作用奠定基础。     

山羊ACSS2基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对山羊乙酰辅酶A合成酶2（acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2）基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量变化。以山羊乳腺组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆山羊ACSS2基因完整CDS区序列,对测序结果进行生物信息学分析,并对ACSS2基因在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量进行分析。结果显示,山羊ACSS2基因CDS区序列长2 106 bp,编码701个氨基酸;山羊ACSS2基因与牛、马、人、犬、猪、小鼠和鸡的同源性分别为97.8%、92.0%、91.3%、91.3%、91.1%、88.1%和73.3%。蛋白理化性质分析结果表明,ACSS2蛋白分子质量为78.72 ku,理论等电点为6.03,属于酸性蛋白;跨膜结构和信号肽分析表明,ACSS2蛋白不含跨膜结构和信号肽;结构域分析表明,该蛋白含有1个乙酰辅酶A合成酶N端结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白主要分布在内质网（44.4%）、线粒体（33.3%）、细胞质（11.1%）和细胞核（11.1%）中。蛋白质结构预测发现ACSS2蛋白含有α-螺旋（29.10%）、延伸链（21.54%）、β-转角（9.84%）及无规则卷曲（39.52%）。实时荧光定量PCR分析结果表明,ACSS2基因在不同泌乳时期均有表达,其中在泌乳中期表达量最高,在干奶期表达量最低。本试验结果为进一步研究山羊ACSS2基因在脂质代谢过程中的功能及转录调控机制提供了参考。     

猪类无精症缺失基因DAZL的cDNA全长克隆、组织表达和亚细胞定位

旨在获得猪类无精症缺失基因DAZL cDNA全长序列,阐明该基因的序列、mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征及亚细胞定位情况。本研究以版纳微型猪近交系（Banna mini-pig inbred line,BMI）10月龄成年公猪为研究对象,屠宰收集组织样,利用RACE和RT-PCR技术获得DAZL基因cDNA全长序列;使用实时荧光定量PCR （qPCR）技术检测其mRNA多组织表达谱;在线分析蛋白质的结构特点和保守结构域;用体外细胞转染技术鉴定其在ST猪睾丸细胞中的定位。结果表明,BMI DAZL cDNA全长2 985 bp （KU705632）,包含888 bp的CDS区,编码295个氨基酸（AOC89050）;该基因位于猪13号染色体,含11个外显子。qPCR结果显示,DAZL mRNA在睾丸中特异高表达。生物信息学分析表明,猪DAZL蛋白含有哺乳动物RMP和DAZ同源区,无规则卷曲在二级结构中超过50%。进化分析表明,BMI DAZL氨基酸序列高度保守,与牛科的亲缘关系最为接近。pEGFP-C1-DAZL转染ST细胞后的荧光共定位结果显示,DAZL蛋白主要分布在细胞核中。本研究分别从DNA、mRNA和蛋白质层面阐明了BMI DAZL基因的序列特征、表达、蛋白质结构和定位,为进一步研究DAZL在BMI精子发生方面的功能奠定基础。     

番鸭ERBB4基因组织表达、克隆及序列分析

试验旨在检测受体酪氨酸蛋白激酶4（receptor tyrosine protein kinase 4，ERBB4）基因在番鸭不同生理状况下脑组织中的相对表达水平，分析其生物信息学功能，探究ERBB4基因是否影响鸭的攻击行为。运用实时荧光定量PCR方法对番鸭的纹状体、下丘脑中ERBB4基因的相对表达量进行检测，通过RT-PCR扩增并克隆ERBB4基因CDS核心区后测序，分析其同源性及遗传进化关系，并结合生物信息学分析工具预测ERBB4蛋白的理化特性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构等。结果显示，ERBB4基因在番鸭两个脑组织中都有一定的表达，在攻击行为番鸭脑组织中的表达量高于正常组，在纹状体中的表达量略高于下丘脑。ERBB4基因核苷酸与氨基酸序列同源性比对显示，ERBB4基因在不同物种间具有一定的遗传多样性，与绿头鸭亲缘关系最近。ERBB4蛋白为亲水性稳定蛋白，氨基酸序列的N端不存在信号肽，存在5个富含呋喃样半胱氨酸（FU）结构域和1个酪氨酸激酶（TyrKc）蛋白结构域，亚细胞定位于细胞质；空间结构以右手α-螺旋和无规则卷曲为主。综上，ERBB4基因可能在番鸭神经系统中发挥重要作用，本研究结果为进一步深入探讨ERBB4基因在番鸭攻击行为中的作用机制提供了参考资料。     

鸡FKBP5基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析

本研究旨在对鸡FK506结合蛋白5（FK506 binding protein 5,FKBP5）基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在鸡不同组织中的表达量。以鸡脾脏cDNA为模板,通过PCR方法扩增和克隆鸡FKBP5基因完整CDS区序列,并进行同源性比对及系统进化树构建;使用在线软件分析FKBP5蛋白的理化性质、疏水性、跨膜结构、信号肽、二级结构和三级结构;利用实时荧光定量PCR检测其在肢体内外翻畸形（valgus-varus deformity,VVD）组肉鸡和正常组肉鸡组织中的表达量,并绘制组织表达谱。结果显示,鸡FKBP5基因CDS区序列全长1 350 bp,编码449个氨基酸;同源性比对和进化树分析表明,鸡FKBP5基因氨基酸序列与鹌鹑、鸭、壁虎、中华鳖、小鼠、人、猪、斑马鱼的同源性分别为98.4%、96.2%、85.8%、87.4%、81.1%、85.2%、86.1%和61.2%,与鹌鹑、鸭的亲缘关系最近,爬行类和哺乳类动物次之,与斑马鱼（鱼类）亲缘关系最远。鸡FKBP5蛋白分子质量为50.43 ku,理论等电点（pI）为5.94,半衰期为30 h,肽链N端为蛋氨酸（Met）,不稳定系数为23.80,属于稳定蛋白;跨膜区和信号肽预测结果显示,FKBP5蛋白不属于跨膜蛋白和分泌型蛋白。结构域分析结果表明,该蛋白包括2个FKBP型肽基脯氨酰异构酶（FKBP-type peptidylprolyl isomerases）、3个四肽重复（TPR）序列,主要包含α-螺旋（46.77%）、延伸链（12.47%）和无规则卷曲（40.76%）,且该蛋白与HSPA2、PPID、STIP1、HSP90AA1和HSP90AB1等互作蛋白具有很强的相关性。实时荧光定量PCR结果显示,FKBP5基因在鸡各组织中广泛表达,其中在软骨和法氏囊中表达量较高,在发病组肉鸡组织中的表达量均高于正常组肉鸡,且在心脏、腿肌、法氏囊、胸腺、软骨中表达量差异显著（P<0.05）,在脾脏中表达量差异极显著（P<0.01）。本试验结果可为肉鸡骨骼疾病及腿部健康选育提供参考。     

白洗猪PID1基因克隆及序列分析

本研究旨在对白洗猪磷酸酪氨酸互作结构域1 (phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID1)基因进行克隆和生物信息学分析。采用Nest PCR及T克隆技术对白洗猪PID1基因进行克隆测序,运用生物学分析软件分析其结构功能及其在种内及种间的遗传进化关系。结果表明,白洗猪PID1基因CDS区全长654 bp,编码217个氨基酸,白洗猪与山东莱芜猪、广西陆川猪PID1蛋白氨基酸同源性为98.2%与97.7%;进化树分析结果表明白洗猪与两个猪种间遗传关系相对较远,种间比对黄牛、牦牛、猕猴、小鼠、眼镜王蛇、人、原鸡、非洲爪蟾、大鼠和斑马鱼PID1蛋白氨基酸同源性依次为96.6%、96.6%、96.3%、95.0%、93.9%、91.7%、90.8%、88.2%、69.7%和67.3%;系统进化树分析表明PID1基因在多物种之间的进化高度保守,结构功能分析表明白洗猪PID1基因功能区主要是编码链氨基酸C端的PTB结构域。本研究成功克隆了白洗猪PID1基因,为探究其对白洗猪肌内脂肪沉积方面的影响及为白洗猪种资源开发利用奠定理论基础。     

Cloning and Sequence Analysis of Lin28 Gene Coding Region from Sheep

The assay was aimed to study the function of Lin28 gene of sheep,in this study,according to the Lin28 gene mRNA sequence of mice,pigs,cattles and human in GenBank,the degenerate primer was designed.Total RNA was extracted by Trizol from intestine of 100 d sheep embro,and CDS sequence of the gene was amplified by RT-PCR using the primer.Using a series of bio-software such as DNAMAN,BioEdit and NCBI BLASTn,PlantsP,ScanProsite online and so on,we analyzed the homologies between nucleotide and deduced amino acid sequences,constructed phylogenetic tree,analyzed protein functional domains and deduced three-dimensional structure of amino acid sequence.The results showed that the sequence of sheep Lin28's CDS including stop codon,was in a length of 630 bp,encoded 209 amino acids.Analysis of homology showed that sheep Lin28 gene also shared 53.8%,55.2%,70.2%,88.3%,88.7%,89.2%,89.5%,90.5%,95.9% and 98.9% nucleotide homologies and 76.5%,67.9%,93.2%,99.3%,97.7%,99.3%,99.3%,98.5%,99.3% and 100.0% amino acid identities with Xenopus laevis,Danio rerio,Gallus gallus,Bos taurus,Equus caballus,Felis catus,Sus scrofa,Homo sapiens,Rattus norvegicus and Mus musculus,respectively.Two zinc finger domains and one cold shock domain could be found by bioinformatics analyzing.The successful cloning of Lin28 revealed that the gene in the structure and function was very conservative and helpful to study gene function and its role in somatic reprogramming in future.     

鸡Rab7b在细胞晚期内吞体定位和结合恒定链的分子特征

Rab蛋白是介导胞内活性蛋白转运的分子家族。恒定链（invariant chain，Ii）具有协助抗原肽转运、B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能。前期研究发现，鸡（Gallus gallus）Rab5a在细胞早期内吞体中与Ii结合，但不清楚是否还有其他转运蛋白有该特性。基于Rab7b分子定位于晚期内吞体，并与胞内分子转运相关，本研究探索了鸡Rab7b与Ii结合的分子结构特征。首先，用自行设计的引物扩增了鸡和小鼠（Mus musculus）Rab7b基因，并进行了氨基酸同源性比对分析；构建了含鸡Rab7b及其67位氨基酸突变体Rab7bQ67L的原核和真核重组质粒。其次，将含红色荧光蛋白和目的基因的重组质粒转染鼠巨噬细胞系Raw264.7，培养后用绿色荧光素（FITC）标记的鼠抗晚期内吞体蛋白1（LAMP1）抗体染色，观察目的蛋白在内吞体的定位。进一步将鸡Rab7b和Rab7bQ67L分别与Ii共转染293T细胞，观察它们与Ii的共定位。最后用拉下法和免疫印迹检测鸡Rab7b及Rab7bQ67L与Ii的结合。结果表明，所克隆获得的鸡Rab7b基因与预期大小一致，其开放阅读框为624 bp，编码208个氨基酸。鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构相似性为74%。尽管鸡Rab7b和突变体Rab7bQ67L均能结合Ii，但只有Rab7b可以定位于晚期内吞体，而突变体却改变了该定位特性。综上所述，鸡Rab7b与Ii不仅在晚期内吞体共定位，而且还能互相结合；鸡Rab7b的第67位氨基酸影响其在细胞内定位而不影响与Ii结合。综上表明，Rab分子参与了Ii在细胞内细胞器的转运，为进一步研究Ii在细胞内的转运机制提供了新的途径。     

Molecular Characteristics of Chicken Rab7b in Localization and Binding Invariant Chain in Late Cell Endocytosis

Rab is a family of molecules that mediate the transport of active proteins in cells. The invariant chain (Ii) has the immunological functions of assisting antigen peptide transport, B cell maturation, and acting as the receptor of cytokines. Previous studies showed that Rab5a of chicken (Gallus gallus) is bound to Ii in the early endocytosis, but it is not clear whether there are other Rab molecules with this property. Based on the localization of Rab7b in late endocytosis and its relationship with intracellular molecular transport, this study explored the molecular structure of Rab7b binding to Ii. First, Rab7b genes of chicken and mouse (Mus musculus) were amplified with self-designed primers, and the amino acid homology was analyzed; the prokaryotic and eukaryotic recombinant plasmids containing Rab7b and its 67 amino acid mutant Rab7bQ67L were constructed. Secondly, the recombinant plasmid containing red fluorescent protein and target gene was transfected into mouse macrophage line Raw264.7. After culture, the recombinant plasmid was stained with FITC labeled mouse anti late endosomal protein 1 (LAMP1) antibody to observe the localization of the target protein. Furthermore, chicken Rab7b and Rab7bQ67L were co-transfected with Ii to observe their co-localization with Ii. Finally, the binding of Rab7b and its mutants to Ii were detected by pull-down technique and Western blotting. The results showed that the Rab7b gene was the same size as expected, and its open reading frame was 624 bp, encoding 208 amino acids. The homology of Rab7b protein structure between chicken and mouse was 74%. Although both Rab7b and Rab7bQ67L could bind to Ii, it was Rab7b rather than Rab7bQ67L could locate in the late endocytosis. In conclusion, Rab7b and Ii were not only co-located in the late endocytosis, but also combined with each other; the 67th amino acid of Rab7b affected its location in cells but not with Ii. These results suggest that Rab molecules are involved in the transport of Ii in intracellular organelles, which provides a new way to further study the mechanism of Ii transport in cells.     

Effects of Donor Cells Treated with Egg Extracts on the Development Competence of Cloned Embryos

Japanese Balck cattle fetal fibroblasts (JBCFF) were induced with Xenopus leavis egg extracts and somatic cell nuclear transfer (SCNT) was carried out with the reprogrammed JBCFF as donor cells in order to investigate their effects on SCNT efficiency.Three samples of egg extracts were acquired from different Xenopus laevis.The protein contents and kinds in extracts were evaluated with BCA Protein Quantification Kit and SDS-PAGE.Concentration of Digitonin to permeabilize JBCFF was optimized and assessed with PI staining.Reprogrammed cells treated with egg extract were used as donor in SCNT.Additionally the reconstructed embryos were activated with ionomycin+6-DMAP and A23187+6-DMAP to compare their effects on the development competence.The protein contents of extracts samples were 56.2255,64.6570 and 71.2158 μg/mL,respectively,the each extract had the same composition about 40-55 and 70-100 ku.The optimal concentration of Digitonin was 7 μg/mL and the permeabilization rate was 55.44%.After extracts treatment and continuous culture for 6-7 d,JBCFF formed well-defined colony structures.No significant composition difference was found in rates of fusion (92.83% vs 96.04%),cleavage (89.64% vs 89.78%) and blastocyst formation (24.06% vs 23.12%) of cloned embryos when the colony cells and JBCFF without extracts treatment were used as donor cells (P>0.05).Similarly,the two activation methods had no significant effect on the developmental competence of cloned embryos (cleavage rate 92.16% vs 92.28%,blastocyst rate 23.21% vs 24.18%).Conclusively,Xenopus leavis,egg extracts could induce JBCFF reprogramming to a low differentiated state.However donor cells with reprogramming partially could not improve the development of cloned embryos and its mechanism requires further research.     

抽提物处理供体细胞对克隆胚胎发育的影响

本研究采用爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(JBCFF),并以发生重编程的细胞为核供体进行体细胞核移植,研究其对克隆效率的影响.分别超排3只爪蟾,收集卵母细胞后提取其抽提物,用BCA蛋白浓度测定试剂盒确定其蛋白含量,SDS-PAGE分析其中所含蛋白的种类.应用细胞膜透化剂Digitonin对建立的JBCFF进行通透处理和PI染色,筛选最适浓度;并用获得的抽提物处理牛体细胞,获得重编程细胞.以发生重编程的体细胞为供体进行核移植,同时比较离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种组合激活后克隆胚的体外发育能力.结果,3个爪蟾卵母细胞抽提物样品的蛋白浓度分别为56.2255、64.6570和71.2158 μg/mL,其中所含蛋白种类一致,主要集中在40~55、70~100 ku之间.经过连续的筛选,透化剂Digitonin对JBCFF通透处理的最适浓度为7 μg/mL,PI染色显示透化效率为55.44%.爪蟾卵母细胞抽提物与体细胞共孵育后继续培养6~7 d,细胞聚集形成"克隆簇".分别以"克隆簇"细胞和未处理细胞为核供体,制备的重构胚在融合率(92.83%和96.04%)、卵裂率(89.64%和89.78%)和囊胚率(24.06%和23.12%)均无显著差异(P>0.05);离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种激活方式对克隆胚胎的分裂率(92.16%和92.28%)和囊胚率(23.21%和24.18%)均无显著影响(P>0.05).爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛体细胞发生重编程,并恢复到较低的分化状态,但没有显著促进克隆胚胎的体外发育,可见缺少对胚胎发育起重要作用的重编程过程,还需要继续深入研究.     

昆明犬IGF-1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在系统研究昆明犬胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）基因的结构和功能，揭示该基因的组织表达规律，为探讨工作犬体型及生长发育性状提供基本数据。以昆明犬为试验材料，运用分子克隆技术扩增IGF-1基因CDS区，应用生物信息学方法进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；同时利用实时荧光定量方法检测该基因在昆明犬各组织的表达情况。结果显示，昆明犬IGF-1基因CDS区长462 bp，编码153个氨基酸，其核苷酸序列与家犬的同源性较高（100%），与小鼠和鸡的同源性较低（82.6%和81.2%）。IGF-1蛋白分子质量和理论等电点分别为16.97 ku和9.36，属亲水性分泌型蛋白，无跨膜结构，存在信号肽区域（第1-48位氨基酸）；亚细胞定位分析表明，IGF-1蛋白主要分布于细胞核（56.5%）及线粒体（17.4%）中；磷酸化位点分析发现，IGF-1蛋白存在15个磷酸化位点；该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。组织表达显示，IGF-1基因在昆明犬不同组织中均有表达，尤其在脾脏、肝脏及肾脏中呈现高表达。本试验结果为今后深入研究IGF-1基因功能提供了理论参考，并为深入探讨IGF-1基因对昆明犬生长发育性状研究提供一定的基础资料。     

山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建

本研究旨在克隆山羊GATA3（GATA binding protein 3）基因,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析。以山羊GATA3基因编码区为种子序列（GenBank登录号：XM_018056969.1）,通过SnapGene 4.1.9软件设计引物序列,应用RT-PCR方法扩增山羊GATA3基因完整编码区序列,测序鉴定后基于其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒。利用脂质体转染方法将慢病毒重组质粒pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1与病毒包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pNRF共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒包装后收集病毒上清液,成功感染山羊耳尖成纤维细胞。结果显示,山羊GATA3基因编码区序列全长1 335 bp,编码444个氨基酸,分子质量为47.94 ku,分子式为C₂₀₉₃H₃₂₃₄N₆₂₆O₆₂₅S₂₄,等电点为9.47,其中丝氨酸含量最高（13.3%）,色氨酸含量最低（1.1%）。山羊GATA3基因核苷酸序列与牛、猪、驴、马、小鼠及人的相似性分别为97.7%、94.2%、92.2%、92.4%、88.0%和90.1%,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性。系统进化树分析表明,山羊与牛、猪、驴、马及人聚为一支,亲缘关系较近,与非洲蟾蜍、斑马鱼亲缘关系较远。跨膜结构域及亲/疏水性预测结果显示,山羊GATA3蛋白不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明,该蛋白定位于细胞质中。通过构建山羊GATA3基因慢病毒真核表达载体pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1,细胞水平上转染HEK-293T和山羊耳尖成纤维细胞,过表达GATA3基因,产生绿色荧光信号。本研究结果为山羊GATA3基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究GATA3基因在山羊泌乳中的作用奠定了基础。