昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

昆明犬胎儿成纤维细胞系的建立及生物学特性分析

本研究旨在探索和建立昆明犬胎儿成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性.试验利用剖腹手术法获得发育30 d的昆明犬胎儿12个,性别鉴定结果为7公5母.公、母胎儿体尺和体重分别为:体长1.90 cm±0.14 cm和2.00 cm±0.05 cm,体宽0.90 cm±0.13 cm和0.90 cm±0.15 cm;体重0.68 g±0.17 g和0.66 g±0.06 g,差异均不显著(P>0.05).以昆明犬胎儿组织为材料,采用胶原酶消化法和细胞冷冻保存技术建立了昆明犬胎儿成纤维细胞系,并对所构建的细胞系进行生物学特性研究.结果表明,分离的胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈S型,倍增时间约为36 h;冻存前和复苏后的存活率分别为96.1%和94.6%;染色体核型分析显示2n=78(XY),并在体外培养多代后仍能保持正常核型.本研究建立的昆明犬胎儿成纤维细胞系可在体外快速贴壁生长、增殖,进行稳定培养,这不仅使昆明犬遗传资源在细胞水平得以保存,且所获成纤维细胞能作为相关研究中所需细胞的来源.     

工作犬高原环境中犬窝咳病的防治

在高原环境中,工作犬因体质下降、应激反应等因素,经常爆发犬窝咳病,病犬容易发生肺水肿,呈现症状严重、并发症多、病程长、死亡率高等特点,严重影响工作犬的作业性能。通过隔离消毒、抗菌消炎、祛痰止咳、扩张支气管、消除肺水肿等综合治疗措施,可提高病犬治愈率;定期接种犬窝咳滴鼻疫苗,加强体质训练,做好犬的保暖工作,防止受寒,能减少犬窝咳病的发生。     

IGF-1基因变异与犬体型及衰老的关系

体型较大往往是预测哺乳动物寿命较长的最佳指标之一,与此形成鲜明对比的是,有相当多的证据表明,在物种内部,体型较大的个体实际上寿命较短。这种体型增大的明显代价在犬上表现得尤为突出,人工选择导致犬种间体型相差近2个数量级,平均寿命相差2倍。胰岛素样生长因子1(IGF-1)是GH/IGF-1和IIS(insulin/IGF-1)通路中关键的调控基因,对各种生物的生长、发育、寿命以及代谢均具有重要作用。IGF-1与犬的体型和寿命都有着千丝万缕的联系,犬可作为一种研究IGF-1基因变异与体型大小和寿命之间关系的模型。论文综述了IGF-1基因变异与犬体型及衰老的研究,为抗衰老相关研究提供参考。     

流式细胞仪分离工作犬XY精子的研究

[目的]探索适用于犬性别控制的流式细胞仪分离精子的方法。[方法]采集昆明犬和德国牧羊犬的精液,采用不同浓度(6、8、10、12μl/ml)的Hoechst 33342对精液进行染色,探讨不同浓度的荧光染料Hoechst 33342及公犬个体对精子分离效果的影响。[结果]当Hoechst 33342浓度分别为6、8、10μl/ml时,X和Y精子的DNA差异不能被分辨成双峰,只有当Hoechst 33342为12μl/ml时,X/Y双峰能有效并稳定地分离。不同公犬的鲜精死精率与X/Y精子分离速度呈明显负相关性,而分离准确率则与鲜精死精率无明显相关性。[结论]当Hoechst 33342浓度为12μl/ml时,流式细胞仪能将警犬X、Y精子成功分离。选择适宜的种公犬对提高精子的分离效率和分离精液的品质都有重要意义。     

外源激素诱导母犬同期发情和排卵试验

为取得良好的同期发情效果和排卵率,采用PMSG和HCG激素联合使用诱导母犬发情和排卵。采用外部观法和公犬试情的发情鉴定方法,观察PMSG和HCG对犬诱导发情的影响,结果:PMSG连用5 d的Ⅱ实验组和连用7 d的Ⅲ实验组均表现出100%的发情率,并且均高于连用3 d的Ⅰ试验组的发情率(40%)和空白对照组的发情率(0%)。同时,利用外科手术的方法观察发情母犬排卵情况,结果:Ⅴ组和Ⅵ组2个实验组均获得了100%发情率,发情母犬分别获得55%和75%的排卵率,且排卵率两者差异显著(P<0.05)。试验证明外源使用PMSG和HCG可以有效诱导乏情期母犬同期发情和排卵。     

公安部昆明警犬基地功勋昆明犬体细胞克隆获得新突破——全国首头警用昆明犬克隆成功,用前沿生物技术致敬一级功勋犬

正2018年12月19日,全国第一头克隆警用昆明犬"昆勋"在京诞生,标志着国内首次实现了警用工作犬的克隆。克隆犬"昆勋"是一头狼青品系昆明犬母犬,其体细胞供体犬是战功赫赫的一级功勋犬"化煌马"(狼青品系昆明犬母犬),警用性能卓越、工作业绩突出。经公安部南昌警犬基地犬DNA实验室鉴定,两者基因组微卫星位点DNA数据完全一致,证实二者存在同一性关系。该成果来源于公安部重点研究计划项目"功勋     

犬在高原低氧环境适应性的研究进展

高原环境中的低氧因素对于栖居在高原上的人类和动物是最极端的生存挑战之一.犬在高原低氧环境下会产生一系列适应性的生理性变化,同时,低氧适应相关基因在机体低氧适应的调控过程中起着非常重要的作用.随着分子生物学技术的发展,越来越多参与低氧适应调控通路的基因被发现.本文就犬在低氧适应性方面的生理变化和相关基因遗传机制的研究进展进行综述.目前犬表现出与低氧适应相关的基因大多涉及低氧诱导信号通路以及血红蛋白血氧结合的通路上.开展低氧适应性研究可以为低氧相关疾病的研究提供生理和遗传基础资料,寻找低氧分子标进行高原耐低氧环境的定向品种培育,同时对高原家养动物特色基因的保存和利用及高原畜牧业的发展具有重要意义.     

昆明犬IGF-1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在系统研究昆明犬胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）基因的结构和功能，揭示该基因的组织表达规律，为探讨工作犬体型及生长发育性状提供基本数据。以昆明犬为试验材料，运用分子克隆技术扩增IGF-1基因CDS区，应用生物信息学方法进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；同时利用实时荧光定量方法检测该基因在昆明犬各组织的表达情况。结果显示，昆明犬IGF-1基因CDS区长462 bp，编码153个氨基酸，其核苷酸序列与家犬的同源性较高（100%），与小鼠和鸡的同源性较低（82.6%和81.2%）。IGF-1蛋白分子质量和理论等电点分别为16.97 ku和9.36，属亲水性分泌型蛋白，无跨膜结构，存在信号肽区域（第1-48位氨基酸）；亚细胞定位分析表明，IGF-1蛋白主要分布于细胞核（56.5%）及线粒体（17.4%）中；磷酸化位点分析发现，IGF-1蛋白存在15个磷酸化位点；该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。组织表达显示，IGF-1基因在昆明犬不同组织中均有表达，尤其在脾脏、肝脏及肾脏中呈现高表达。本试验结果为今后深入研究IGF-1基因功能提供了理论参考，并为深入探讨IGF-1基因对昆明犬生长发育性状研究提供一定的基础资料。