沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7双重荧光PCR检测方法的研究

目的建立一种能同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的快速检验。方法根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应条件,建立可同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的检验,并与miniVIDAS快速初筛方法和SN标准方法进行比较。结果本研究建立的双重荧光PCR方法可同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7,对纯菌的检测灵敏度均低于10CFU/双重荧光PCR反应体系。应用本方法检测36株标准/参考菌株,结果只有9株目的菌标准/参考菌株出现特异性扩增,其余27株非目的菌均呈阴性反应。定量检测重复性试验结果,批内和批间的变异系数均小于2%。应用本方法检测人工染菌样品,结果与miniVIDAS和SN方法检测结果一致,但检测时间比miniVIDAS快了3倍,比SN标准快了10多倍。结论本研究建立的双重荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点,可在8小时内完成样品沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的检验。     

3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系的建立及初步应用

建立一种同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的快速、灵敏、高通量的检测方法。利用特异性免疫磁珠,在37℃条件下从200 mL样液体系中循环捕获目标致病菌。磁珠液提取DNA后,对3种病原菌进行多重IMS-荧光RPA检测。结果表明:针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的检测限分别达到3.0、4.5和8.7 CFU/mL。使用新建多重IMS-荧光RPA方法对人工感染60份皮张、毛皮纺织品DNA样本进行扩增,结果显示与预期结果一致;对60份公共场所收集的皮张、毛皮、纺织品DNA样本进行扩增,结果显示有2个样本沙门氏菌阳性、1个样本大肠杆菌O157:H7阳性,3份阳性样品送测序,测序结果与GenBank检索沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 DNA序列一致。得出结论:建立的多重IMS-荧光RPA检测体系灵敏度、特异性、准确度符合要求,能够在2 h内完成对3种病原菌检测,可以作为快速应对此三类病原菌安全突发事件的检测手段。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank公布的大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfb E、鞭毛抗原基因fli C、溶血素基因hly A、紧密黏附素基因eae A和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfb E/eae A、Stx1/hly A、fli C/Stx2探针5'端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端均标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度高,stx1、rfb E、fli C、eae A、hly A、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8 h后测得大肠杆菌O157:H7的最低检出限分别为200 cfu/m L与1 cfu/m L。以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的方法。     

多重荧光PCR检测水产品致病菌方法的建立与应用研究

根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157：H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯茵的检测灵敏度均低于1O cfu／PCR反应体系。人工染菌样品经6h增菌,检测的灵敏度可低于10c...     

应用多重PCR方法检测出血性大肠杆菌O157:H7

选择O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)分别设计引物,在同一扩增体系中进行PCR反应。在优化好的多重PCR反应条件下,对菌株及其它肠道菌进行检测。试验结果为：O157：H7菌株在250,207,179bp处均出现特异条带。试验结果表明,选择3对引物的多重PCR方法可特异、快速而且灵敏地对大肠杆菌O157：H7进行检测。     

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测试剂盒的研制

为了研制一种快速、准确诊断大肠杆菌O157:H7的PCR方法,试验根据GenBank收录的大肠杆菌O157:H7全基因组序列,设计并合成了2对可扩增rfbE(O157)和Flic(H7)基因片段的特异性引物,建立双重PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明:该检测试剂盒对大肠杆菌O157:H7能特异性地扩增出rfbE和Flic基因的目的片段;对大肠杆菌O157:H30、O157:H9、O157:H25、O157:H19只能扩增出rfbE而不能扩增出Flic基因的目的片段;对大肠杆菌DH5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段;细菌DNA的最低检测极限是50 pg;在-20℃条件下保存1,3,6,9,12个月后,其敏感性都没有发生改变,均能检测到50 pg的大肠杆菌O157:H7DNA模板。     

定点屠宰场（点）猪肉中三种主要食源性致病菌污染情况调查

为了解本地生猪定点屠宰场(点)猪肉中的沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌3种食源性致病菌污染情况,对10个场(点)出场的猪肉进行抽样,采用沙门氏菌测试片、大肠杆菌O157:H7测试片及李斯特菌检测板进行快速检测,再用国标法对快速检测出的阳性样品进行复检鉴定。结果显示:50份样本中,检出沙门氏菌阳性7份,阳性检出率为14%;20份样本中,检出大肠杆菌O157:H7阳性1份,阳性检出率为5%,检出单增李斯特菌阳性5份,阳性检出率为25%。此外,还发现样本中存在细菌的混合污染,其中沙门氏菌和单增李斯特菌双阳性2份,3种菌全阳性1份。调查结果表明:本地屠宰场出场猪肉中,这3种主要食源致病菌污染情况较严重,特别是小型屠宰点,应引起监管部门重视,加快推进屠宰企业转型升级;快速测试片的检测结果准确性偏低,特异性差,需要尽快建立一种快速特异的检测方法,用于屠宰场的致病菌快速检测。     

大肠杆菌O_(157)∶H)7荧光PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立大肠杆菌O157∶H7荧光PCR检测方法,试验参照Gen Bank中已发表的大肠杆菌O157∶H7的O抗原RFBE基因序列,针对保守区序列设计了特异性引物和探针,优化了反应体系和反应程序,评价了该方法的特异性、敏感性、重复性,并进行了临床样品检测。结果表明:该方法的特异性和重复性好,具有较高的敏感性,最低检测浓度为5 cfu/mL;用该方法检测60份冻肉样品,得到的结果与传统的细菌分离鉴定法一致。说明建立的大肠杆菌O157∶H7荧光PCR方法是快速鉴定大肠杆菌O157∶H7的有效方法,具有较大的应用价值。     

应用测试片快速检测食品中的大肠杆菌O157：H7

目的应用大肠杆菌O157:H7测试片快速检测食品中的大肠杆菌O157:H7。方法对大肠杆菌O157:H7测试片的各项指标及影响因素进行测试,并将其应用于食品检测。结果大肠杆菌O157:H7测试片的检测灵敏度高,其对纯菌的检测低限可达3cfu/mL;特异性较强,与鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌等21种非目的菌无交叉反应;快速,24h内可报告阴性检测结果。应用该测试片检测各种食品206份,检测结果与SN标准的符合率达到98.5%。结论应用测试片检测食品中的大肠杆菌O157:H7具有快速、方便、经济、无需昂贵设备等优点。该测试片可适应于食品中大肠杆菌O157:H7的快速初筛。     

2015—2017年酒泉市部分地区羊肉制品食源性病菌污染情况调查

为初步了解并分析酒泉市部分地区羊肉制品中食源性致病菌的污染情况,于2015—2017年对酒泉市5个县市随机采集羊肉制品827份,参照食品国家安全标准对采集的样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血性孤菌和单核细胞增生李斯特菌污染情况进行了调查。结果显示:共有116份样品被检测出携带食源性致病菌,检出率14.03%,其中金黄色葡萄球菌74份(8.95%)、沙门氏菌23份(2.78%)、副溶血性孤菌12份(1.45%)、单核细胞增生李斯特菌7份(0.85%),没有检出大肠杆菌O157:H7;2015—2017年检出率分别为24.05%、12.09%和7.75%;不同羊肉制品中以油炸肉检出率最高(48.65%),生肉最低(5.67%)。说明酒泉市羊肉制品中食源性病菌污染较为严重,其中主要以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为主,给消费者健康造成潜在的威胁,相关部门需要提高食品安全监管力度。     

Percoll分离法与多重PCR快速检测肉品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌

为从食品中有效分离致病菌,去除PCR反应的抑制因子,提高多重PCR检测灵敏度,本研究利用Percoll密度梯度离心的前处理法从鲜肉样品中高效分离沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌,以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因,经过PCR分别扩增出255 bp、506 bp、620 bp的DNA片段,DNA测序证实这些片段为目的扩增产物。该体系检测猪肉匀浆液中3种致病菌的灵敏度为6.2×103 cfu/mL、1.2×103 cfu/mL和2.4×103 cfu/mL,检测时间约6 h。Percoll前处理法与多重PCR检测肉中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为同时检测肉类样品中多种致病菌提供了有效的检测方法。     

3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157 ∶ H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法.针对大肠杆菌O157 ∶ H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行...     

三重荧光PCR检测食源性致病菌方法的建立与初步应用

根据大肠杆菌O157的rfbE基因、志贺肠杆菌ipaH基因、单增李斯特杆菌hlyA基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌的多重实时荧光PCR方法。试验结果显示,该方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行3联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×10~2、5×10~2和5×10~3CFU/mL;对10株标准/参考菌株的检测结果,只有目的菌株呈阳性反应;用该方法检测26份冻肉样品,与传统的细菌分离鉴定法结果一致,说明研究建立的方法是鉴定3种食源性致病菌的有效方法。     

免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157):H_7及毒力基因的PCR检测

为了了解新疆不同牛场中大肠杆菌O157:H7的流行情况,对新疆乌鲁木齐、伊犁地区、塔城地区多个牛场采集的粪样及水样样本的检测,样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的疑似大肠杆菌O157:H7菌株做PCR检测,同时结合生化试验的方法进行符合性检验。结果从新疆3个地区不同牛场的208份样品分离得到5株肠出血性大肠杆菌O157:H7,检出率为2.4%。其中粪样检出5株,检出率为2.4%;水样未检出。生化试验结果表明,5株分离出的大肠杆菌O157:H7菌株与国标规定的O157:H7特性相同。表明,部分被检牛场存在大肠杆菌O157:H7威胁,应该引起重视。     

五重PCR检测大肠杆菌O157:H7菌体抗原和毒素基因

针对O157：H7大肠杆菌O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应，而单一毒素基因并不是O157：H7所独有这一特点，建立了五重和四重PCRA-法，同时检测大肠杆菌O157：H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因，可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157：H7，并有较高的特异性，解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低，并有交叉反应等问题。     

大肠杆菌O157:H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157:H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157:H7快速定量检测的实时定量PCR方法.该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍.方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157:H7,对非大肠杆菌O157:H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应.利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157:H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌.为建立一种特异、灵敏的O157:H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157:H7活菌EMA-PCR检测方法.结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL.经EMA处理,从含有1％～100％O157:H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段.因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157:H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高.O157:H7 EMA-PCR技术的建立为O157:H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景.     

鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的方法,本研究根据沙门氏菌inv A基因和大肠杆菌O78 O-抗原特异基因序列设计引物,并在细菌16S r DNA区设计内参引物,通过各项参数调整优化,建立了能够直接从样品中同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的多重PCR检测方法。结果显示:该方法可以同时扩增出O781 113 bp和沙门氏菌821 bp的特异片段以及细菌16S r DNA 527 bp的通用片段,而对于其他13种肠道致病菌只能扩增出527 bp的细菌同源片段,具有较强的特异性。该体系检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的最低检出限分别为10~3cfu/m L和10~2 cfu/m L。增菌5 h,鸡粪模拟污染菌样品中沙门氏菌和大肠杆菌O78的检测灵敏度分别为10~3 cfu/m L和10~2 cfu/m L。本研究建立的检测方法能够在8 h内完成鸡粪样品中两种靶标菌的快速检测,对于沙门氏菌和大肠杆菌O78的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。     

猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用

为快速诊断和检测猪链球菌病,根据GenBank中已登录的猪链球菌抗原基因保守区域序列,设计并合成特异性引物及Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应体系及扩增条件,构建了快速、准确检测猪链球菌的Taqman荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR),测定了该方法的灵敏性、重复性和特异性,并对疑似猪链球菌临床感染样本进行了检测。结果显示:所建立的Taqman FQ-PCR方法检测灵敏度为1×10~2拷贝/μL;对3种不同浓度的猪链球菌重组质粒进行3次重复扩增,变异系数均小于3%,说明重复性好;特异性检测显示,只有猪链球菌样本的扩增曲线呈阳性反应,其他致病菌均无荧光信号;采用此方法,对30份临床疑似猪链球菌感染样本进行检测,发现有27份样本为阳性,比采用国标法检测得到的结果更加灵敏。结果表明,建立的FQPCR方法具有灵敏性高、重复性好、特异性强等特点,可用于猪链球菌的快速诊断和检测。     

大肠杆菌O_(157):H_7 PCR-ELISA检测方法的建立

为了建立大肠杆菌O157:H7微孔板固相捕获呈色探针快速检测方法,试验根据GenBank网站公布的大肠杆菌O157:H7血清型基因序列设计1对特异性引物和探针,进行聚合酶链式反应、核酸杂交、酶联显色,测定吸光度值,并对此快速检测方法的特异性和敏感性进行研究。结果表明:大肠杆菌O157:H7吸光度值为2.214,敏感性试验最低检测限为每25 mL菌液中有1 cfu。