猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因（登录号：KC461235.1）,并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28 ℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1：102 400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫效力研究

本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTAORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

施马伦贝格病毒核蛋白在昆虫细胞中的表达

参照NCBI公布的施马伦贝格病毒(SBV)的N基因开放阅读框序列,设计了一对含特异性酶切位点的引物,扩增SBV N基因,将其克隆于昆虫杆状病毒表达载体p Fast Bac HTB,然后以该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N,将该重组穿梭质粒在脂质体介导下转染Sf 9昆虫细胞,得到表达SBV重组N蛋白的杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blot对重组N蛋白进行鉴定,表明该蛋白得到表达。本研究为以SBV核蛋白为基础的相关检测方法的建立提供了物质基础。     

小反刍兽疫病毒F蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组质粒F-p Fast Bac HTA,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒F-Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,获得含有PPRV F基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出59 ku左右的表达蛋白,Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测该蛋白具有很好的反应原性。通过免疫BALB/c小鼠,ELISA结果证明F蛋白可以诱导产生高水平的血清抗体;MTT试验结果显示F蛋白能刺激T淋巴细胞增殖;说明表达的F蛋白具有良好的免疫原性。以上研究结果为小反刍兽疫病毒的检测方法及亚单位疫苗的研究奠定基础。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

表面展示猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)核定位序列部分缺失的ORF2基因(pdCap),将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的pBACsurf-1质粒中,得到重组质粒pBACsurf-1-pdCap。再将含有pdCap和gp64的融合基因克隆到杆状病毒并转移到质粒pFastBac^TM Dual中,得到重组质粒pFastBac-pdCap。然后将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组穿梭质粒Bacmid-pdCap。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-pdCap。间接免疫荧光和Western blotting试验结果表明,该重组杆状病毒成功表达了具有良好反应原性的pdCap蛋白。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性分析

将非典型犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA（rBacmid-N）,脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹（Western blot）分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。     

传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究传染性造血器官坏死病病毒（infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV）主要结构蛋白糖蛋白（G）,本研究采用RT-PCR方法从IHNV中提取RNA并进行反转录,经PCR方法扩增获得1 380 bp的G蛋白基因片段,将其克隆到pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中,成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G,转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得了重组杆粒rBacmid-G。将重组杆粒转染至Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒。间接免疫荧光（IFA）和Western blotting分析显示,重组G蛋白可与抗组氨酸单抗（Anti-His）、抗IHNV鼠血清发生特异性反应,表明本研究克隆的IHNV G蛋白在真核表达系统中得到正确表达,且该蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为研究G蛋白的功能及开发IHNV新型疫苗奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白的单链抗体在昆虫细胞中表达及活性检测

为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV） gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LIC-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VH-VL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30 ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。     

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2（MRJP2）,为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q Exactive）对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达

以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。     

Construction of Baculovirus Expression System and Antigenicity Analysis of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus Glycoprotein

To study the major structural protein glycoprotein (G) of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), glycoprotein gene (1 380 bp) was amplified by RT-PCR from IHNV. In order to construct a recombinant plasmid pFB-LIC-Bse-G, G gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse. Then, the constructed plasmid pFB-LIC-Bse-G was transformed into E.coli DH10Bac. The recombinant bacmids rBacmid-G was got, and then it was transfected to insect Sf9 cells,and the recombinant baculovirus that contained G gene was obtained. Western blotting analysis and indirect immunofluorescence assay (IFA) showed that the recombinant G protein could be recognized by histidine monoclonal antibody (Anti-His) and anti-IHNV antibody of mouse. The results indicated IHNV G protein had been expressed correctly in Sf9 cells. The study laid a foundation for further studying the G protein structure, function and immunological characteristics.     

Expression and Biological Activity of Single Chain Antibody Against gD Glycoprotein of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus in Insect Cells

For preparation of bioactive single chain fragment variable (ScFv) which was targeted against envelope glycoprotein D (gD) of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV),VH and VL genes were amplified from the cDNA of lymphocyte hybridoma, then VH and VL genes were integrated with a Linker by SOE-PCR,and the ScFv gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse, which was transformed into Escherichia coli DH10Bac competent cells to construct a recombinant bacmid rBacmid-VH-VL. Finally,ScFv was expressed by transfected rBacmid-VH-VL into insect Sf9 cells, its molecular weight was about 30 ku. The result of Western blotting suggested that ScFv generated in Sf9 cells was specifically binds to His antibody,the protein also showed high affinity to gD of IBRV. The result of indirect immunofluorescence assay showed that ScFv could recognize IBRV which infected bovine kidney cells (MDBK). The study indicated that the recombinant ScFv was expressed in Sf9 cells, and could bind to gD of IBRV specifically. The result could provide the basis for the diagnosis and treatment of infection of IBRV.     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。