血清3型火鸡疱疹病毒疫苗与血清1型CVI988疫苗的效力比较

用血清3型火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗和血清1型CVI988疫苗免疫SPF白来航鸡后,分别攻击国内马立克氏病(MD)标准强毒京-1株和国际MD标准超强毒(VVMDV)RB1B株。结果表明,HVT和CVI988免疫组攻击京-1株或RB1B株与相应攻毒对照组相比,保护指数差异极显著(P<0.01)。HVT和CVI988疫苗抗京-1株攻毒的保护效果相似(保护指数分别为93.75%和93%),而CVI988疫苗抗RB1B株的攻击效果优于HVT疫苗(保护指数分别为92.6%和75.3%),但差异不显著(P>0.05)。CVI988疫苗抗京-1株和RB1B株的效果(分别为93%和92.6%)无显著差异(P>0.05),HVT疫苗抗京-1株和RB1B株的效果(分别为93.75%和75.3%)存在一定差异,但差异不显著(P>0.05)。     

产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体的免疫保护力评价

旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因片段克隆至原核表达载体pET30a-(+)中进行表达,并纯化。利用Western blot方法检测纯化蛋白质与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清的反应性,并检测其对小鼠的毒力。随后,以纯化的重组蛋白质免疫兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,ε毒素的重组突变体为可溶性表达,通过灰度扫描,其表达量比例可达40%;该蛋白质能与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清反应,小鼠安全试验显示,6.25×106 ng·kg-1的蛋白质仍无毒力;免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌ε毒素的中和效价在一免后可达50~60最小致死量(MLD),二免后可达400~450 MLD;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到保护。由此表明,产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性,为D型产气荚膜梭菌病新型疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

鸡传染性支气管炎的诊断报告

北京西郊农场畜禽公司于1986年11月10日购进AA肉用型雏鸡2803只,雏鸡从3日龄表现呼吸症状,10日龄开始死亡,到50日龄时死亡达1100只,到80日龄鸡群淘汰时共死亡1350只,死亡率为47.4%。确定为鸡传染性支气管炎。     

不同pH值的稀释液对马立克氏病冻干疫苗的稳定性作用

本试验将马立克氏病(MD)冻干疫苗稀释液用1NNaOH或1NHCl调成不同的pH值,分别稀释MD冻干疫苗(参照品),测定其稀释MD冻干疫苗后对疫苗的保护作用,以确定稀释液的最佳pH值范围。1　材料和方法1.1　MD冻干疫苗(参照品)　中监所生产。1.2　稀释液(SPG)　按《兽用生物制品质量标...     

鸭瘟活疫苗外源病毒检验方法（鸡检查法）的修订

对二〇〇五年版《中华人民共和国兽药典》中鸭瘟活疫苗外源病毒检验的鸡检查法进行了修订,确定选用9-12周龄SPF鸡,在原药典规定方法的基础上增加低剂量基础免疫程序,并用该外源病毒检验方法对5批鸭瘟活疫苗进行了验证,结果表明修订后的鸭瘟活疫苗外源病毒检验方法可靠,可操作性强。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒H120株和H52株种毒的制备与鉴定

鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株种毒由中国兽医药品监察所制备和供应,种毒的保存期为10年,为了保证种毒的质量和供应,需要定期制备种毒。将H120株、H52株毒种接种SPF鸡胚进行传代培养,收获鸡胚尿囊液,与50 g/L牛乳蔗糖溶液等体积混匀,进行分装和冷冻真空干燥。对其进行剩余水分测定、真空度测定、病毒含量、安全性、免疫原性、纯净(无菌检验、支原体检验、外源病毒)和特异性检验,检验结果表明,各项检验均符合规定。同时为了区分H120株、H52株种毒,用实验室已建立的RT-PCR和酶切方法对2种种毒进行鉴别检验,结果表明能准确区分H120株和H52株种毒。试验结果为疫苗生产提供了能长期保存且稳定性好、高滴度的生产用种毒,也可为其他禽源病毒种毒的制备提供借鉴。     

重组C型肉毒梭菌毒素的表达与免疫保护性分析

本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白（MBP）和C型肉毒梭菌毒素重链C末端（CH_C）的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCH_C。将GMBPCH_C克隆至pET28a-（＋）后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在15和37℃两种温度条件下诱导表达。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rMBPCH_C。将rMBPCH_C与Montanide ISA 201佐剂混合制备成疫苗,免疫4只家兔,剂量为100 μg/只。根据《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测一免后21 d及二免后14 d家兔血清的中和抗体效价。同时,在二免后14 d对家兔进行攻毒。结果表明,rMBPCH_C在37℃的诱导温度下,主要以包涵体的形式表达;在15℃的诱导温度下,可溶性表达的比例可达50%。一次免疫后,免疫组4只家兔血清对C型肉毒梭菌天然毒素（简称天然毒素）的中和效价均可达到1（0.1 mL血清中和1个小鼠最小致死量（MLD）的天然毒素）。二免后,家兔血清的中和抗体效价可达到4~8。用10个家兔MLD的天然毒素攻毒后,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护,而用1个家兔MLD的天然毒素攻毒后,对照组家兔100%（2/2）死亡。以上结果说明,rMBPCH_C具有良好的免疫原性,从而为C型肉毒梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体大肠杆菌表达条件的优化

本研究旨在优化产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达条件,为下一步大规模生产ε毒素基因工程亚单位疫苗奠定基础。以本实验室构建的产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体为基础,通过控制变量法确定诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度以及诱导时菌液浓度等原核蛋白表达条件。结果表明,ε毒素的重组突变体在37 ℃、菌液OD600值为0.895~1.295时,以1.6 mM IPTG诱导6 h条件下可溶性表达量最高。     

呼肠孤病毒弱毒S1133株特性研究

呼肠孤病毒S1133株细胞毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长良好，每0．1mL病毒液可达10^6.5～10^7.5TCID50。以10^4.5TCID50／只接种3周龄SPF雏鸡无致病性。免疫雏鸡可抵抗强毒足垫攻击，未免疫对照鸡则不能抗强毒攻击。表明该毒株安全且具有良好的免疫原性。