产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体的免疫保护力评价

旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因片段克隆至原核表达载体pET30a-(+)中进行表达,并纯化。利用Western blot方法检测纯化蛋白质与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清的反应性,并检测其对小鼠的毒力。随后,以纯化的重组蛋白质免疫兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,ε毒素的重组突变体为可溶性表达,通过灰度扫描,其表达量比例可达40%;该蛋白质能与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清反应,小鼠安全试验显示,6.25×106 ng·kg-1的蛋白质仍无毒力;免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌ε毒素的中和效价在一免后可达50~60最小致死量(MLD),二免后可达400~450 MLD;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到保护。由此表明,产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性,为D型产气荚膜梭菌病新型疫苗的研制提供了重要的实验数据。