唾液酸受体在大鼠肠黏膜微血管内皮细胞中的表达

肠黏膜微血管内皮细胞在肠道中广泛存在,为研究流感病毒唾液酸α2,3半乳糖(SAα2,3Gal)和α2,6半乳糖(SAα2,6Gal)两种受体在肠黏膜微血管内皮细胞表面的表达情况,本试验利用植物凝集素免疫荧光染色方法和流式细胞术分别进行了定性和定量分析。结果显示,大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIM-MVECs)表面同时表达唾液酸α2,3-半乳糖和α2,6-半乳糖两种受体,即同时表达人流感病毒受体和禽流感病毒受体,并且唾液酸α2,6半乳糖的表达量显著高于α2,3半乳糖受体的表达量。该试验结果表明,RIM-MVECs可以被人源和禽源流感病毒感染,且更易被人源流感病毒感染。     

流感病毒受体特异性红细胞检测试剂的制备及初步应用

为优化流感病毒受体特异性的检测方法,本研究利用霍乱弧菌神经氨酸酶(VCNA)对鸡红细胞(RBC)进行去唾液酸化处理后,再分别通过α2,3和α2,6唾液酸转移酶以CMP-唾液酸作为底物进行不同唾液酸受体的标记,使其分别仅含SAα2,3Gal和SA2,6Gal受体,利用血凝试验和流式细胞仪检测其标记效果。流式检测结果显示,经过α2,3唾液酸转移酶处理的红细胞只含有SAα2,3唾液酸受体,而α2,6唾液酸转移酶只将SAα2,6唾液酸受体标记到红细胞表面。将两种红细胞分别经过人流感病毒和禽流感病毒的检测,表明该方法可以快速鉴定流感病毒的受体特异性。本研究所建立的流感病毒受体特异性标记和检测方法为流感病毒宿主嗜性范围的检测提供了一种有效的技术手段。     

流感病毒受体结合与抗原性改变的分子基础

流感病毒的血凝素(HA)与宿主细胞表面糖链末端唾液酸(SA)的结合对流感病毒感染宿主起着至关重要的作用。禽流感病毒对SAα2-3Galβ糖链以及人流感病毒对SAα2-6Galβ糖链的结合特异性使跨种属传播受阻,但不同的流感病毒在猪和陆地家禽等中间宿主体内发生基因重配作用后,可使部分禽流感病毒获得适应性感染人的能力,另一方面,流感病毒自身的基因突变,尤其是受体结合部位周围的特定位点,可导致流感病毒受体结合特异性发生转变,而病毒的变异伴随着自身糖修饰和抗原表位的改变,使机体对其免疫识别结合的能力也随之发生变化。这些分子水平的改变都将对病毒相关的宿主受体结合和免疫应答反应产生影响。     

新城疫病毒受体在不同动物细胞上的分布比较

细胞表面的SAα2,3Gal和SAα2,6Gal2种糖链可以作为新城疫病毒(NDV)入侵靶细胞的受体,但这2种糖链在不同动物细胞上的分布和相对丰度存在差异,为明确不同动物细胞上NDV受体的分布和相对含量,分别对鸡胚成纤维细胞、鹅胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞以及Vero细胞,使用糖链检测试剂盒进行凝集素细胞原位免疫组织化学检测,FITC/PI双染色后激光共聚焦显微镜观察比较不同禽类细胞上受体分布。结果表明鸡胚成纤维细胞和Vero细胞表面同时分布有SAα2,3Gal和SAα2,6Gal2种受体,而鹅胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞表面则只分布有SAα2,3Gal受体,缺乏SAα2,6Gal受体,提示NDV受体在不同禽类细胞表面的分布存在种属差异性。     

SPF鸡各组织中流感病毒唾液酸受体的分布

为了解SPF鸡体内各组织中流感病毒唾液酸受体分布状况,本研究采用凝集素免疫荧光组织染色的方法,系统检测了流感病毒唾液酸受体在SPF鸡呼吸系统、消化系统以及其它系统各组织中的分布,并进行半定量分析。结果表明,大部分组织中均同时存在唾液酸α2,3-半乳糖受体与唾液酸α2,6-半乳糖受体,只有少部分组织仅存在其中一种受体,这种受体分布的广泛性与流感病毒组织噬性相一致;但鼻甲与喉头中唾液酸受体明显低于许多其他组织,这也表明不能简单的通过唾液酸受体的有无或者密度高低来判定病毒在各组织中的实际分布与复制增殖情况,或许还有其他机制参与了病毒入侵与增殖的过程。     

唾液酸受体在家禽肾和生殖系统组织中的表达

为了观察流感病毒唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖两种受体在鸡、鸭两种家禽肾脏和生殖系统组织中分布和表达的特征,本研究利用凝集素免疫荧光组织染色方法对各器官组织进行了系统的定性分析。结果显示,唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖这两种受体在鸡、鸭肾脏和生殖系统中皆有分布,其中唾液酸α2,3-半乳糖的分布更为广泛。这一研究结果提示,鸡、鸭肾脏和生殖系统组织细胞对禽流感病毒和人流感病毒都存在易感的基础,且更容易感染禽源的流感病毒。     

流感病毒受体在三种动物气管和肺脏分布的组织化学检测

利用凝集素组织化学染色的方法,对岭南黄鸡、番鸭和BALB/C小鼠的气管和肺脏进行了流感病毒受体分布的检测。结果表明:在岭南黄鸡、番鸭和小鼠的气管粘膜层、粘膜下层、肺脏的细支气管和肺泡上皮细胞均有禽流感病毒受体的分布。番鸭和小鼠气管和肺脏的人流感病毒受体的分布范围和细胞类型与禽流感病毒受体的分布稍有差异,岭南黄鸡气管和肺脏未检测到人流感病毒受体的分布。研究结果为探讨流感病毒的感染机制和宿主特异性的差异提供了基础数据。     

糖基化影响H9N2亚型禽流感病毒在小鼠体内复制能力和对α-2,6唾液酸受体的亲和性

利用反向遗传操作技术验证了H9N2亚型禽流感病毒流行株(A/Chicken/Shandong/903,简称903)HA蛋白200和295位氨基酸糖基化可以影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,同时也能影响病毒在小鼠体内复制能力。固相ELISA结果显示,突变病毒N200Q(N→Q)和N295Q(N→Q)都能降低病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性。荧光定量结果显示,突变病毒N295Q主要在小鼠肺脏、脾脏和肾脏中复制(M基因拷贝分别为903野毒的56,64,39倍);而突变病毒N200Q主要在小鼠肾脏中复制(M基因拷贝分别为903野毒的936倍)。本试验为阐明H9N2亚型流感病毒跨种间传播的分子机制提供依据。     

H9N2亚型禽流感病毒对鸡输卵管致病性的研究

为了研究H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)对鸡输卵管的致病性,本研究首先采用凝集素亲和组化染色法检验了流感病毒受体SAα-2,3Gal在鸡输卵管上的分布;然后用H9N2 AIV人工感染产蛋母鸡,制作输卵管的病理组织切片观察其病理变化;最后,采用胶原酶Ⅰ灌注消化法培养鸡输卵管膨大部的原代上皮细胞,接毒H9N2 AIV后观察细胞病变.试验结果表明,鸡输卵管除漏斗部没发现SAα-2,3Gal受体,其余部分均呈强阳性分布;攻毒后病理组织切片观察,输卵管膨大部上皮细胞绒毛脱落,部分细胞坏死、脱落,组织间隙变大,子宫内部组织内部充血出血,其他部分变化不明显;原代细胞接毒72 h后,细胞病变不明显,但是上清中HA滴度可以达到3log2.从以上三方面可以看出,鸡输卵管上皮细胞膜上存在禽流感病毒受体,H9N2 AIV可以引起侵害鸡输卵管,并引起部分输卵管病变,而且H9N2 AIV可以感染鸡输卵管膨大部原代上皮细胞,H9N2 AIV有可能通过输卵管感染母鸡.     

H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/GD/2/12基因特征分析

2012年从广东省某猪场的疑似流感猪群采集鼻拭子样品,接种鸡胚并收集尿囊液,通过血凝、血凝抑制和RT-PCR,鉴定出1株H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/GD/2/12。RT-PCR扩增得到全基因8个片段,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树,发现本毒株可能是H1N1亚型重组株,其8个片段与我国猪源和北美地区1985—1992年间的猪源、禽源(A/turkey/IA/1992)和人源(A/Maryland/12/1991)流感毒株在同一个大分支上,其中与我国猪源参考株同源性在95.8%以上,与北美地区的H1N1参考株同源性在94%以上。HA受体位点分析表明,本毒株既具备结合Saα2,6Gal型人类流感病毒SA受体的特点,也有结合Saα2,3Gal型禽类流感病毒SA受体的可能。提示本毒株可能是由北美地区猪源、禽源和人源的H1N1亚型流感病毒重排形成的。HA蛋白裂解位点分析、NS和PB2蛋白位点分析表明,本毒株具备低致病性毒株的特点。小鼠致病性试验进一步证实本毒株能够引起小鼠运动减少、食欲欠佳、体重减轻等表现,但不会引起咳嗽和死亡等严重反应。     

壳聚糖-唾液酸寡糖离子复合物对流感病毒感染的抑制作用

随着流感病毒抗药性的出现,开发有效的新型药物势在必行。流感病毒的结合受体是唾液酸寡糖,这些受体位于宿主细胞的表面,是抗病毒药物开发的潜力靶标。中国科学院微生物研究所李学兵研究员带领的团队研制了一种新的流感病毒入侵抑制物——壳聚糖-唾液酸寡糖离子复合物,该复合物通过阳性壳聚糖和阴性唾液酸寡糖的非共价吸附作用形成,对流感病毒感染的抑制效果明显。研究结果2月25日在线发表于《Carbohydrate Polymers》。     

流感病毒受体特异性间接ELISA检测方法的建立

本研究采用过碘酸钠法对去唾液酸胎球蛋白进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,然后通过两种不同类型的唾液酸转移酶对HRP去唾液酸胎球蛋白进行唾液酸标记,使其成为只含有单一受体的载体。利用MAA和SNA以及已知受体特性的两株流感病毒对唾液酸标记的HRP去唾液酸胎球蛋白进行受体结合特异性鉴定。结果表明,该方法可以快速准确的鉴定流感病毒的受体特异性。     

禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展

神经氨酸酶是禽流感病毒的两种表面糖蛋白之一,是一种由AIV基因组第6节段编码的Ⅱ型糖蛋白。宿主细胞膜上的唾液酸（SA．又名神经氨酸）是流感病毒的主要受体。流感病毒与宿主细胞膜上SA受体结合后,才能进入细胞。而神经氨酸酶可以降解AⅣ识别的宿主细胞膜上的受体,抑制病毒进入细胞。神经氨酸酶的这一独特功能特点使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一,同时也为制备抗禽流感转基因家禽提供了理论依据。本文简要综述了禽流感病毒的背景知识,着重介绍了神经氨酸酶的结构与功能以及目前国内外神经氨酸酶的研究状况,并对其今后的研究和应用进行展望。     

鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖诱导的小鼠急性炎症的影响

试验旨在探讨鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性炎症的影响。将24只SPF雌性小鼠随机分成4组:PBS组,LPS模型组,重组UBC13蛋白高、低剂量组(分别为100和25μg/只),每组6只。LPS模型组与各蛋白剂量组腹腔注射20 mg/kg LPS,PBS组腹腔注射等体积PBS;注射结束1 h后,各蛋白组按相应剂量背部皮下多点注射重组UBC13蛋白,PBS组与LPS模型组注射等体积PBS。给予蛋白24 h后处死小鼠。收集小鼠肺脏、脾脏、胸腺及肝脏组织,计算脏器指数,HE染色观察组织病理学变化,实时荧光定量PCR检测肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的相对表达量,以及肺脏中iNOS mRNA的相对表达量,综合评价鼠源重组UBC13蛋白对LPS诱导小鼠急性炎症的影响。结果显示,与PBS组相比,LPS模型组小鼠肺脏、脾脏及肝脏指数均显著或极显著升高(P0.05;P0.01),且肺脏、脾脏和肝脏组织均出现病理变化。实时荧光定量PCR结果显示,与PBS组相比,LPS模型组肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量均极显著升高(P0.01),肺脏中iNOS mRNA相对表达量也极显著升高(P0.01);与LPS模型组相比,UBC13蛋白高剂量组肺脏、脾脏和肝脏中病理变化明显改善,肺脏、肝脏、脾脏中IL-1β、TNF-α、IL-6及肺脏中iNOS mRNA表达量均极显著降低(P0.01);胸腺中TNF-αmRNA表达量显著降低(P0.05),IL-6 mRNA和IL-1β表达量极显著降低(P0.01)。表明鼠源重组UBC13蛋白可下调炎性因子的表达,从而改善LPS诱导的小鼠急性炎症反应。     

流感病毒 HA 受体结合位点抑制剂研究进展

目前临床所用控制流感病毒的药物和疫苗受到病毒耐药性、疫苗滞后性等诸多因素的限制,使能阻止病毒侵入宿主细胞的抑制剂成为当前研究的热点。唾液酸是流感病毒囊膜表面血凝素（HA）的受体,但研究表明唾液酸并不适合作为研制流感病毒侵入宿主细胞抑制剂的结构模型。研究发现流感病毒的HA 受体结合位点必须外露才能与宿主细胞受体结合,因此 HA 受体结合位点可以被宿主免疫系统监视,成为抗体潜在的靶向契合位点。随后发现的 HA 受体结合位点抗体能与 HA 受体结合位点的保守氨基酸残基结合,能有效阻止流感病毒感染宿主。因此,可用 HA 受体结合位点抗体作为流感病毒感染抑制剂的模型,研制流感病毒抑制剂。论文就流感病毒 HA 的分子结构和功能,HA 结合受体的机制,HA 受体结合位点抗体以及该类抗体对流感病毒的抑制效果进行了阐述,以期对以 HA 受体结合位点抗体为模型研制流感病毒感染抑制剂提供帮助。     

猪H3N2亚型流感病毒受体亲和性鉴定

利用固相酶联方法对分离自吉林省猪群中的3株H3N2亚型流感病毒进行了受体亲和性鉴定.结果显示,这3株病毒与SAα2,3和SAα2,6受体都能结合,并且偏嗜SAα2,6受体,暗示它们具有感染人的潜能.因此应该加强猪流感的流行病学调查,及时发现那些具有引发人流感流行潜能的病毒,为防控人间流感提前做好准备.     

浅谈流感病毒的H A突变与受体识别的关系

近年来,经常发生禽流感病毒由禽类传染给人类的事件,但禽流感病毒在人与人之间却未发生传播,其机制可能是由于流感病毒表面的HA糖蛋白与靶细胞表面的唾液酸受体结合具有特异性。本文主要从A型流感病毒与人类受体结合的特异性、HA氨基酸的突变对禽流感感染人类的影响以及HA突变对流感病毒传播能力的影响等方面初步探讨了流感病毒HA突变与受体识别的关系,以期能为将来人们研究流感病毒的感染和传播机制提供思路。     

鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖诱导的小鼠急性炎症的影响

试验旨在探讨鼠源重组UBC13蛋白对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性炎症的影响。将24只SPF雌性小鼠随机分成4组:PBS组,LPS模型组,重组UBC13蛋白高、低剂量组(分别为100和25μg/只),每组6只。LPS模型组与各蛋白剂量组腹腔注射20 mg/kg LPS,PBS组腹腔注射等体积PBS;注射结束1 h后,各蛋白组按相应剂量背部皮下多点注射重组UBC13蛋白,PBS组与LPS模型组注射等体积PBS。给予蛋白24 h后处死小鼠。收集小鼠肺脏、脾脏、胸腺及肝脏组织,计算脏器指数,HE染色观察组织病理学变化,实时荧光定量PCR检测肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的相对表达量,以及肺脏中iNOS mRNA的相对表达量,综合评价鼠源重组UBC13蛋白对LPS诱导小鼠急性炎症的影响。结果显示,与PBS组相比,LPS模型组小鼠肺脏、脾脏及肝脏指数均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),且肺脏、脾脏和肝脏组织均出现病理变化。实时荧光定量PCR结果显示,与PBS组相比,LPS模型组肺脏、脾脏、胸腺和肝脏中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量均极显著升高(P<0.01),肺脏中iNOS mRNA相对表达量也极显著升高(P<0.01);与LPS模型组相比,UBC13蛋白高剂量组肺脏、脾脏和肝脏中病理变化明显改善,肺脏、肝脏、脾脏中IL-1β、TNF-α、IL-6及肺脏中iNOS mRNA表达量均极显著降低(P<0.01);胸腺中TNF-αmRNA表达量显著降低(P<0.05),IL-6 mRNA和IL-1β表达量极显著降低(P<0.01)。表明鼠源重组UBC13蛋白可下调炎性因子的表达,从而改善LPS诱导的小鼠急性炎症反应。     

TLR2和TLR4受体封闭肽对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的影响

Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是参与天然免疫的一类重要的模式识别受体,在天然免疫和获得性免疫反应过程中发挥着重要的作用。观察TLR2和TLR4受体封闭肽对LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)mRNA表达的影响,探讨TLR2和TLR4受体在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞过程中对TNF-αmRNA表达影响的机制。分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,采用荧光定量PCR技术检测了TLR2和TLR4受体封闭肽对LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α基因表达的影响。结果显示,与LPS刺激组相比较,CP对照组TNF-α基因的表达量无显著性差异(P>0.05),TLR2和TLR4受体封闭肽作用组TNF-α基因和蛋白的相对表达量极显著性降低(P<0.01)。由此可知,TLR2和TLR4受体封闭肽对促炎性细胞因子TNF-α基因的表达存在抑制效果。     

苦参碱对PRRSV/LPS共刺激诱导小鼠炎症反应的作用

通过猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和脂多糖(LPS)共刺激诱导小鼠炎症反应,探索苦参碱的抗炎机制。试验选取100只雌性昆明系小鼠,设置空白组、PRRSV组、LPS组、PRRSV和LPS共刺激组、苦参碱作用组。LPS和PRRSV共刺激30 min后腹腔注射40 mg/kg·bw苦参碱,每隔24 h给药1次,连续给药3次;共刺激1 d和7 d后,通过检测小鼠肺脏病理变化、血细胞中各种白细胞数变化、肺脏中IL-1β和TNF-αmRNA以及脾脏中Treg和Th17细胞的表达阐释苦参碱的抗炎作用。结果表明,PRRSV和LPS共刺激诱导小鼠严重的肺脏病理变化,主要表现为典型的间质性肺炎,苦参碱处理后影响血液中各种白细胞的含量以及肺脏中IL-1β和TNF-α的表达。苦参碱通过抑制白细胞的变化以及IL-1β和TNF-α的表达来改善PRRSV/LPS共刺激诱导的间质性肺炎。