苦参碱对感染PRRSV Marc-145细胞受体表达的影响

为探讨苦参碱在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染Marc-145细胞过程中的抗病毒机制。本研究建立感染PRRSV的Marc-145细胞模型,将试验分为4组:细胞对照组、病毒对照组、苦参碱对照组和苦参碱试验组,每组重复3次。PRRSV感染细胞3,6,12,24h后,收集细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测苦参碱对PRRSV N基因及其细胞受体CD163、Vimentin和CD151的影响。结果表明,在PRRSV感染24h内苦参碱显著降低PRRSV N基因的表达(P0.05)。与病毒对照组相比,在PRRSV感染6h时,苦参碱可显著降低CD163的表达量(P0.05);在PRRSV感染3,6h,苦参碱试验组Vimentin的表达量显著降低(P0.05);在PRRSV感染3,24h时,CD151的表达量显著低于病毒对照组(P0.05)。以上结果表明苦参碱在PRRSV感染Marc-145细胞的不同时间点可通过抑制细胞不同受体的表达来抑制PRRSV吸附和侵入宿主细胞,从而干扰PRRSV在细胞中的复制。     

甘草酸体外抗PRRSV的作用机制

为了研究甘草酸体外抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的作用及机制,本试验确定了甘草酸的抗PRRSV作用,并通过检测甘草酸对病毒的吸附侵入、核酸复制等环节对病毒的结构蛋白、非结构蛋白以及宿主细胞受体和IFN-α表达的影响确定甘草酸体外抗PRRSV的作用机制。结果显示,甘草酸阻断PRRSV感染时减少了GP4的表达,并降低CD163和CD151的表达;抑制PRRSV吸附时抑制了PRRSV GP4和细胞CD163的表达;抑制PRRSV侵入时抑制了GP4的表达,并显著提升细胞CD163和CD151的表达;抑制增殖的作用机制是抑制细胞内PRRSV nsp9和nsp10的表达,前期抑制病毒引起的TLR3表达升高的趋势,后期促进TLR3的表达;中后期降低、末期促进IFN-α的表达。结果表明,甘草酸能通过调节PRRSV的蛋白、宿主细胞受体和细胞因子的表达来抑制PRRSV体外感染Marc-145细胞。     

Marc-145细胞CD151蛋白主要抗原表位区的表达及其与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染关系的研究

为研究CD151与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的关系,根据GenBank中已发表的CD151蛋白的基因序列设计并合成一对特异性引物,从Marc-145细胞中扩增出294 bp的CD151基因片段并克隆入pGEX4T-3载体,转化人大肠杆菌用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.表达蛋白纯化后用于免疫小鼠制备抗CD151蛋白血清,用ELISA和IFA检测抗血清的效价及特异性.将抗CD151蛋白血清与Marc-145细胞孵育后再感染PRRSV,观察细胞CPE验证该血清对PRRSV的阻断效果.结果表明成功构建了pGEX4T-3-CD151,获得了相对分子质量为37 ku的重组CD151蛋白.制备的抗血清特异性结合Marc-145细胞并有效阻断PRRSV感染Marc-145细胞.这些研究结果为进一步阐明CD151与PRRSV感染的关系提供一定的理论基础.     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。     

针对nsp9基因的siRNA在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

为了验证猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp9基因对PRRSV的复制影响,化学合成针对nsp9基因的siRNA,转染到Marc-145细胞中,接种PRRSV之后分别通过荧光定量和Western blot方法来测定病毒的滴度变化和表达情况。结果发现,转染siRNA的Marc-145细胞中病毒的滴度低于未转染特定siRNA的对照组,同时N蛋白的mRNA和蛋白水平均低于未转染特定siRNA的对照组。初步得出结论nsp9基因为病毒复制关键基因,针对nsp9基因的siRNA会在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制。     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。     

核因子I/A(NFIA)依赖其N末端的DNA结合结构域抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)严重危害世界养猪业,目前仍无有效防控策略,因此探究宿主内源性蛋白拮抗PRRSV的分子机理意义重大。前期试验发现核因子I/A(nuclear factor I/A,NFIA)可以有效抑制PRRSV复制,故本试验以非洲绿猴胚胎肾细胞Marc-145细胞为模型,对NFIA抑制PRRSV复制的分子机理进行了深入探究。首先,构建NFIA的N末端DNA结合结构域缺失质粒pcDNA3.1-Flag-ΔN和C末端转录激活结构域缺失质粒pcDNA3.1-Flag-ΔC并分别转染Marc-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后用qRT-PCR和Western blot的试验方法分别检测病毒N蛋白的RNA和蛋白表达水平。结果显示ΔC仍能有效降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,但ΔN则不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,这表明NFIA的N末端结构域是抑制病毒的关键。其次,对NFIA全长质粒pcDNA3.1-Flag-WT进行N末端结构域内不同功能位点的双碱基突变,分别破坏掉NFIA的促腺病毒复制功能(Mut1,YR86～87WL)、DNA结合功能(Mut2,LR119～120VD)和二聚化功能(Mut3,LF135～136VD),将突变质粒分别转染Marc-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后通过qRT-PCR和Western blot检测发现,Mut2和Mut3不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,说明N端结构域的DNA结合功能位点和二聚化功能位点是NFIA抑制PRRSV复制的关键。结果表明,核因子I/A(NFIA)主要依赖其DNA结合结构域的二聚化与DNA结合功能来抑制PRRSV复制。     

长链非编码RNA NEAT1通过Wnt/β-catenin信号通路影响PRRSV复制机制的初步研究

长链非编码RNA(LncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,对于调节多种生命活动发挥着重要作用。为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与LncRNA核富集转录体1(NEAT1)相互作用的分子基础,本研究将PRRSV(MOI 1)感染Marc-145细胞,分别在感染后不同时间(0、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、60 h、72 h)收集细胞,提取细胞总RNA,反转录为cDNA,利用qRT-PCR方法检测PRRSV对Marc-145细胞内NEAT1转录的影响,结果显示:PRRSV感染显著上调Marc-145细胞内NEAT1的转录水平(p0.001);将不同MOI(0.1、0.5、1、2)PRRSV感染Marc-145细胞48 h后收集细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测PRRSV对Marc-145细胞内NEAT1转录的影响,结果显示,不同MOI的PRRSV对NEAT1的转录水平影响不显著;将PRRSV(MOI 1)感染Marc-145细胞48 h后,采用RNA荧光原位杂交(RNAscope)方法检测PRRSV感染对NEAT1在Marc-145细胞内分布的影响,结果显示,NEAT1定位于Marc-145细胞核,PRRSV感染诱导核内NEAT1的转录水平上调(p0.01);将NEAT1-C0、C1、C2、C3、C4、C5和C6分别转染Marc-145细胞12 h后,接种PRRSV(MOI 0.1)24 h,采用q RT-PCR方法检测NEAT1各个片段对PRRSV复制的影响,结果显示,NEAT1各个片段过表达均可抑制PRRSV ORF7 mRNA的转录,其中C4区域的抑制效果最佳(p0.001);将NEAT1-C4转染Marc-145细胞36 h,采用q RT-PCR方法检测NEAT1-C4对细胞因子分泌的影响,结果显示,过表达NEAT1-C4上调Marc-145细胞内IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10、细胞性骨髓瘤病病毒癌基因(c-myc)和细胞周期蛋白1(cyclinD1)的转录水平(p0.001);将TOP、NEAT1-C4和PGL4.74共转染Marc-145细胞36 h,同时将FOP、C4和PGL4.74共转染Marc-145细胞作为对照,利用双荧光素酶报告基因方法检测NEAT1-C4对Wnt/β-catenin通路活性的影响,结果显示,过表达NEAT1-C4显著增加LEF1/TCF转录因子的转录活性(p0.01),及诱导Wnt/β-catenin通路的活化。上述结果首次证实了LncRNA NEAT1通过C4段区域上调Marc-145细胞内Wnt/β-catenin信号通路的活性从而抑制PRRSV的复制。本研究为探究PRRSV与宿主之间的相互作用及PRRSV致病机制提供参考依据。     

LGALS1对猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145中复制的影响

为探索LGALS1对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145中复制的影响,设置LGALS1免疫血清和PRRSV共同孵育Marc-145细胞的试验组、LGALS1 siRNA转染Marc-145细胞后再接种PRRSV的试验组以及PRRSV直接孵育Marc-145细胞的对照组,利用间接免疫荧光、TCID_(50)测定、荧光定量和Western blot来测定病毒的增殖、滴度变化和表达情况。结果发现,抗LGALS1血清组、转染LGALS1 siRNA质粒组与对照组荧光、TCID_(50)、病毒mRNA和蛋白水平差异均不显著。结果表明,LGALS1对PRRSV在Marc-145中复制无影响。     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

Antiviral activity and underlying molecular mechanisms of Matrine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus in vitro

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), is an acute infectious disease. The prevalence of PRRS has made swine industry suffered huge financial losses. Matrine, a natural compound, has been demonstrated to possess anti-PRRSV activity in Marc-145 cells. However, the underlying molecular mechanisms were still unknown. The main objective of our study was to discuss the effect of Matrine on PRRSV N protein expression and PRRSV induced apoptosis. Indirect immunofluorescence assay (IFA) and Western blot were used to assess the effect of Matrine on N protein expression. Apoptosis was analyzed by fluorescence staining. In addition, the effect of Matrine on caspase-3 activation was investigated by Western blot. Indirect immunofluorescence assay and Western blot analysis demonstrated that Matrine could inhibit N protein expression in Marc-145 cells. And Matrine was found to be able to impair PRRSV-induced apoptosis by inhibiting caspase-3 activation.     

Establishment and Identification of One Marc-145 Cell Line Stably and Highly Expressing Porcine CD163

This study was attempted to generate one Marc-145 cell line stably and highly expressing porcine CD163 (pCD163) and set the foundation for PRRSV isolation and vaccine production.CD163 was shown to be a cellular receptor capable of mediating infection of PRRSV non-permissive cell lines.The pCD163 gene was amplified by RT-PCR from porcine alveolar macrophages and cloned into the eukaryotic expression vector pCI-neo, then the positive plasmid pCI-pCD163 was transfected into Marc-145 cells.After selecting with G418 and subcloning for 3 times, Marc-145 cell line expressing pCD163 was established.IFA results indicated that the fluorescence of pCD163-Marc cells was significantly brighter than Marc-145 cells;Western blotting results indicated that the pCD163-Marc cells could express higher levels of CD163 and the expression level was 8.7 times higher than Marc-145 cells.The pCD163-Marc cell line could be stably passaged for 20 passages and the expression level of CD163 was similar with different passages, which would be a valuable tool for facilitating virus propagation and vaccine production.     

稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系的构建

为了构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的Marc-145细胞系,以PRRSV全长感染性克隆为模板,通过PCR方法扩增PRRSV N基因,将N基因克隆到慢病毒载体中,获得重组质粒pLenti-CMV-N,利用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒转导至Marc...     

辣蓼黄酮正丁醇部分体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

为明确辣蓼黄酮正丁醇部分（n-butanol part of flavonoids from Polygonum hydropiper L.,FNB）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的效果。本研究以Marc-145细胞和PPRSV弱毒疫苗毒株（TJM-F92）为对象,通过CCK-8法检测FNB对细胞的毒性作用,并检测先给药后接毒、先接毒后给药、药物与病毒同时作用这3种方式处理细胞后药物对病毒的抑制率。结果发现,FNB对细胞的最大安全浓度为500 μg/mL,因此,选择25~500 μg/mL浓度范围的FNB进行后续试验。各浓度的FNB处理病毒后,能不同程度的抑制PRRSV在细胞上的增殖,并呈现一定的剂量效应关系,药物的浓度越高,抗病毒效果越好。其中,先接毒后给药、药物与病毒同时作用这两种方式抗PRRSV效果显著,在25~500 μg/mL浓度范围内细胞存活率分别为21.55%~65.23%和24.85%~73.60%。而先给药后接毒,不能有效降低病毒的感染力,在药物最高剂量（500 μg/mL）时细胞存活率仅为7.00%,抗病毒效果不明显。FNB预先作用于Marc-145细胞虽未降低PRRSV感染细胞的能力,即药物对于PRRSV预防作用效果不理想,但是FNB对病毒感染细胞后呈现一定的作用,药物能够通过抑制病毒的合成、释放及直接杀灭病毒,进而能够有效抑制PRRSV在细胞上的增殖。本试验结果不仅为FNB在临床上治疗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供参考依据,而且可以为辣蓼的深度开发和利用提供理论依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSVHB-3株GP5、M和N基因,通过I,inker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因-起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-MN免疫Balb／c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体（1：4）,随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高（1：32）。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

Proteomic alteration of Marc-145 cells and PAMs after infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus

Viral infections usually result in alterations in the host cell proteome, which determine the fate of infected cells and the progress of pathogenesis. To uncover cellular protein responses in porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), infected pulmonary alveolar macrophages (PAMs) and Marc-145 cells were subjected to proteomic analysis involving two-dimensional electrophoresis (2-DE) followed by MALDI-TOF-MS/MS identification. Altered expression of 44 protein spots in infected cells was identified in 2D gels, of which the 29 characterised by MALDI-TOF-MS/MS included 17 up-regulated and 12 down-regulated proteins. Some of these proteins were further confirmed at the mRNA level using real-time RT-PCR. Moreover, Western blot analysis confirmed the up-regulation of HSP27, vimentin and the down-regulation of galectin-1. Our study is the first attempt to analyze the cellular protein profile of PRRSV-infected Marc-145 cells using proteomics to provide valuable information about the effects of PRRSV-induced alterations on Marc-145 cell function. Further study of the affected proteins may facilitate our understanding of the mechanisms of PRRSV infection and pathogenesis.     

PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定

为制备只包含抗体可变区片段(Fv)的MAb2-5G2单链抗体(scFv),本研究从分泌MAb2-5G2的杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录制备cDNA作为模板扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因.以VH-1inker-VL的形式通过重叠PCR制备scFv基因,构建重组表达质粒pEasy-scFv,并在大肠杆菌中获得正确表达.通过western blot和间接免疫荧光鉴定表明scFv蛋白能够被兔抗MAb2-5G2的抗体(Ab3)识别,复性后的scFv蛋白能够特异性结合Marc-145细胞.该研究结果为进一步明确MAb2-5G2结合Marc-145细胞功能区域奠定了物质基础.     

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组（P<0.05）,是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。