兽药人工抗原合成的研究进展

在兽药的免疫化学残留分析中,能否合成稳定的具有良好免疫原性的人工抗原是制备抗体和建立免疫分析方法的最关键步骤.综述了国内外兽药人工抗原合成过程中载体的选择、半抗原的设计（强调偶联部位和间隔臂的引入）、半抗原与载体的偶联方法、人工抗原的纯化与鉴定等方面的研究进展.     

氨基脲人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

目的合成氨基脲人工抗原并制备其多克隆抗体。方法以氨基脲(SEM)和对醛基苯甲酸(CP)为原料合成半抗原(CP-SEM),并采用碳化二亚胺法和混合酸酐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成氨基脲人工抗原。以氨基脲人工抗原(CPSEM-BSA)为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA法测定其抗体效价。结果经薄层层析、红外光谱和元素分析等方法鉴定合成半抗原即为CP-SEM。紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明人工抗原合成成功。免疫获得抗氨基脲的多克隆抗体,其抗体效价为1:64000。结论氨基脲人工抗原合成成功,并获得抗氨基脲的多克隆抗体。     

人工抗原的合成及单克隆抗体的纯化

制备单克隆抗体，建立优化ELISA方法检测兽药残留过程中，人工抗原的合成是较重要的步骤。对人工抗原合成时半抗原和载体的选择，化学反应的类型及应注意的事项进行了阐述，以期促进兽药残留分析的发展。     

抗阿维菌素抗体的研制

本文合成了二个模拟阿维菌素特征结构的半抗原，４‘＝Ｏ－（单）琥珀酰阿维菌素和５－Ｏ－（单）琥珀酰阿维菌素。将半抗原与载体蛋白连接，制成人工抗原。     

三聚氰胺半抗原及完全抗原的合成与鉴定

本研究合成了三聚氰胺半抗原及完全抗原并鉴定合成是否成功,为制备三聚氰胺抗体奠定基础。将2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和3-巯基丙酸的反应合成半抗原3-(4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基硫代)丙酸,采用质谱鉴定和红外光谱鉴定;通过活性酯法将半抗原分别与牛血清白蛋白、卵清蛋白进行偶联制备完全抗原,采用紫外光谱法初步鉴定,后经动物免疫进一步验证。结果表明半抗原与完全抗原合成成功,为后续的抗体制备奠定了基础。     

二氟沙星人工抗原的合成与鉴定

通过化学方法合成了二氟沙星人工免疫原和包被原；采用碳二亚胺法将半抗原二氟沙星与载体蛋白BSA连接制备人工免疫原；并采用氯甲酸异丁酯法将二氟沙星与载体蛋白OVA连接制备人工包被原，经FeCl3显色反应、紫外扫描分析和动物免疫试验证实人工抗原合成成功。这对抗二氟沙星单克隆抗体的制备具有重要意义。     

兽药单克隆抗体研究进展

兽药大多属于小分子物质(半抗原),没有免疫原性,必须与载体交联成人工合成抗原(完全抗原)才能获得免疫原性,用人工合成的抗原来免疫动物制备兽药单克隆抗体。对兽药单克隆抗体的研究是随着兽药残留检测技术发展而开始的,人们已经在制备兽药单克隆抗体所需技术如兽药人工抗原合成的方法、选择合成兽药人工抗原的所需载体、对兽药结构的改造、免疫动物的注射方式、免疫程序、杂交瘤细胞的筛选及培养等方面进行一些研究,并成功地制备出十几种兽药单克隆抗体,且大多已应用于兽药免疫测定法(IAs)。目前仅有一种兽药单克隆抗体已应用于兽药免疫亲和色谱(IAC)。     

氟虫腈单克隆抗体的制备及其在牛乳检测中的应用

合成氟虫腈人工完全抗原,制备氟虫腈单克隆抗体,以氟虫腈及氟虫腈类似物为半抗原,分别采用戊二醛法和碳二亚胺法合成人工完全抗原;利用紫外光谱扫描法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行鉴定;使用氟虫腈-牛血清蛋白人工完全抗原免疫BALB/c小鼠,得到杂交瘤细胞株,采用小鼠体内诱生腹水方法制备单克隆抗体;使用酶联免疫吸附测定法测定氟虫腈在牛乳中的加标回收率及精密度。结果表明：氟虫腈的人工完全抗原合成成功,制备的单克隆抗体3F6质量浓度为8.5 mg/mL,效价为2.0×106,亚型为IgG1,与氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的交叉反应率分别为9.21%、14.02%、21.46%;氟虫腈在牛乳中的加标回收率为87%～118%,变异系数低于15%,方法具有较高准确度和精密度。     

动物组织中四环素类抗生素残留的ELISA检测研究——土霉素抗体的制备

四环素类抗生素属小分子半抗原物质 ,必须与大分子物质结合才能产生免疫原性。本试验采用重氮化法合成土霉素 牛血清白蛋白 (BSA OTC)及土霉素 鼠血清白蛋白 (RSA OTC)人工抗原 ,用紫外扫描对其进行鉴定。以BSA OTC免疫家兔制备抗血清 ,以RSA OTC为包被抗原 ,采用双向免疫扩散法和ELISA方法对抗血清进行鉴定。结果表明用重氮化法合成的人工抗原对四环素类药物有特异的抗原抗体反应 ,抗血清效价达 1 2 8× 1 0 5,完全能够满足四环素类药物残留的ELISA检测要求     

呋喃唑酮人工抗原的制备

[目的]制备呋喃唑酮人工抗原。[方法]通过重氮化法和戊二醛法将半抗原FZ与载体蛋白质牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)耦联,制备人工免疫抗原和检测抗原,经SDS-PAGE电泳鉴定人工抗原是否耦联成功,用紫外可见分光光度计法测定耦联蛋白浓度。[结果]SDS-PAGE结果显示,用2种方法制备的人工抗原FZ-BSA和BSA、FZ-OVA和OVA的2组蛋白条带迁移距离均发生了变化,耦联物的迁移距离均小于其相对应的载体蛋白。[结论]通过SDS-PAGE鉴定呋喃唑酮人工抗原制备成功。     

多西环素人工抗原的合成与鉴定

建立多西环素人工抗原(Doxycycline,DOX)的合成及鉴定方法。采用戊二醛偶联法将DOX分别与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原(DOX-BSA)和包被抗原(DOX-OVA)。经SDS-PAGE电泳法、紫外可见吸收光谱鉴定,证实人工抗原成功合成,偶联比分别为8.6∶1和3.8∶1。结果表明建立了一种新的DOX抗原合成方法,为进一步制备特异性DOX抗体和建立检测食品中DOX的酶联免疫方法奠定了基础。     

多西环素人工抗原的合成与鉴定

将多西环素（doxycycline,DOX）进行化学修饰引入羧基或氨基等活性基团,然后与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA和包被原DOX—PABA—OVA、DOX～OVA,并用紫外吸收（UV）、凝胶电泳（SDS—PAGE）和EUSA方法对人工抗原进行鉴定;将合成的人工抗原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA分别免疫BALB／C小鼠,用间接ELISA方法测定多抗（pAb）效价,用竞争ELISA方法鉴定其敏感性,用交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,二个免疫组6只小鼠血清抗体效价均在1：6400以上,DOXpAb对DOX的50％抑制浓度（IC50）在39．79～53．13μg/L,抗血清与四环素类药物交叉反应很低。本实验为建立多西环素ELISA残留免疫学检测方法和并制备多西环素试剂盒奠定了基础。     

展青霉素人工抗原的制备与鉴定

为探讨展青霉素（patulin,PAT）不同抗原合成方法对完全抗原制备及抗体产生的影响,本试验利用琥珀酸酐联合活泼酯法,分别制备免疫原PAT-BSA和包被原PAT-OVA。为提高PAT与偶联蛋白的结合率,尝试将BSA修饰为EDA-BSA后与PAT进行偶联,并对比2种偶联方法制备的完全抗原免疫动物后抗血清的效价水平。同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶渗透色谱多种方法分析鉴定偶联结果,为PAT单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

禽类食品中磺胺二甲嘧啶间接竞争ELISA检测方法的建立

试验采用高碘酸钠法合成了磺胺二甲嘧啶的人工SMZ-BSA和SMZ-OVA,紫外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定证明抗原耦联成功。在此基础上,建立间接竞争ELISA法,将磺胺二甲嘧啶添加到鸡蛋和鸡肉样品中,分别用ELISA和高效液相色谱(HPLC)分析方法检测。结果表明,在0.1~50 ng/mL浓度范围内,方法的检测灵敏度IC₁₀=0.18 ng/mL。鸡蛋实际样品的检出限可达到2.0 ng/g,鸡肉实际样品检出限可达到5.0 ng/g。研究建立的ELISA方法与HPLC方法具有较高的相符性,可用于鸡蛋与鸡肉样品中磺胺二甲嘧啶残留含量分析的大量样品的筛查。     

己烯雌酚免疫分析技术研究进展

己烯雌酚为人工合成的二苯乙烯类雌激素药物,曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧业。但国内研究表明,己烯雌酚存在着潜在的致癌性。因此,近年来,其在饲料及动物性食品中的残留检测倍受关注,但己烯雌酚属于小分子化合物,不具备免疫原性。己烯雌激酚人工抗原主要采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将半抗原己烯雌酚与载体蛋白牛血清蛋白连接制备人工免疫原,并采用碳二亚胺法将半抗原己烯雌酚与载体蛋白卵清蛋白连接制备人工包被原。文章对己烯雌酚的免疫分析技术进行了综述。     

Establishment of ELISA Detection Method for Neomycin in Import and Export Animal

This experiment used carbodiimide get egg albumin synthesis of artificial antigens coupling neomycin,through square test to determine the best antigen packaged concentration and antibody dilution ratio,mass concentration logarithm of neomycin as abscissa,inhibition rate of antibody as the ordinate drawing standard curve,established ELISA fast detection techniques of neomycin in edible animal for import and export.Methods of recovery and specific test had been done in further research.Results showed that the test dilution ratio of optimum synthetic antigen was 1:200,the best dilution multiple of antibodies was 1:2 000, half inhibitory concentration(IC₅₀) was 6.99 ng/mL;The minimum detection limit of the method was 40 ng/mL,and cross reaction rate of gentamicin, kanamycin, streptomycin,tobramycin,amikacin and dihydrostreptomycin were less than 0.1%,the average of recovery rate was 83.77%.The range of standarding curve in 1.5~40 ng/mL was linear,the correlation coefficient was 0.987,the equation of standarding curve was y=-37.66x+94.592;Compared with HPLC method,the operation was simple and fast.The test results showed that the enzyme-linked immunosorbent method of detecting neomycin was rapid,efficient and specific.     

二喹噁啉羟酸全抗原偶联比HPLC测定方法的建立

为建立一种准确、可靠的测定人工抗原偶联比方法,本试验应用高效液相色谱法方法测定全抗原二喹噁啉羟酸—牛血清白蛋白(QCA-BSA)合成中游离二喹噁啉羟酸的含量。采用Waters 2695分离系统、2489紫外检测系统;流动相:甲醇∶水(60∶40);柱温:30 ℃;流速:1 mL/min; 检测波长320 nm。试验结果表明,游离二喹噁啉羟酸的线性范围为0.2~128 μg/mL,线性方程为y=17526x+4648,R²=1,RSD为0.28%,全抗原QCA-BSAⅠ、Ⅱ、Ⅲ的偶联比分别为1.76∶1、28.60∶1、65.63∶1。建立的方法准确、可靠,适用于喹噁啉类人工抗原偶联比的测定。