饲料中鱼源性成分真实性鉴别研究

研究旨在建立标准化的饲料中鱼源性成分的PCR检测方法,以形成行业标准推广使用.应用鱼源性引物对35种鱼类、24种非鱼类动物和10种植物样品进行PCR检测,只在35种鱼类中出现224 bp特异扩增条带,在其他的非鱼类动植物DNA中未出现扩增条带.实验表明,PCR检测方法具有特异性,检测限为0.1 ng DNA和0.1 %(W/W).应用该方法对上海口岸进口的100个鱼粉样品进行检测,均能检出鱼源性成分.研究建立的标准化饲料中鱼源性成分PCR检测方法能应用于日常检验检疫工作,可推广使用.     

牛乳中无乳链球菌PCR快速检测方法的建立

根据GenBank公布的的SIP基因序列,设计一对特异性引物,通过对PCR方法的优化,建立了牛无乳链球菌性乳房炎的快速PCR检测方法。用建立的PCR检测方法对患牛乳中无乳链球菌总DNA进行扩增．获得大小为945bp的DNA片段。特异性试验表明,停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DNA均未扩出条带;敏感性试验表明,该对引物能够检测到的最低DNA浓度为1．25ng;重复试验表明该方法具有良好的重复性和稳定性。     

应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原

通过对丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri,Mmc)特异性引物MmcF/MmcR和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumontiae,Mo)特异性引物LmF/LmR退火温度、引物浓度比例等条件的选择,建立了一个可以同时检测Mmc和Mo的双重PCR方法。该方法可同时扩增出Mmc 195 bp和Mo 361 bp目的片段,但对其他病原菌不能扩增出任何条带,具有良好的特异性。敏感性试验表明,该方法能够分别检测出0.1ng的Mmc DNA和0.01 ng的Mo DNA,或同时检测出1ng Mmc和1ng Mo混合的DNA。用该双重PCR方法可对实验室保存的4株绵羊肺炎支原体和2株丝状支原体山羊亚种进行准确鉴定,并可从临床病料中检测出相应支原体,表明建立的双重PCR方法可用于Mmc和Mo的快速鉴定、实验室诊断和病原学调查。     

检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

为了建立一种快速检测牛奶中布鲁氏菌的方法,本研究采用套式PCR的方法,通过对PCR条件的优化,改进布鲁氏菌提取DNA方法,经验证,最佳退火温度50.1℃、dNTP最佳浓度为0.2 mM、引物最佳浓度为0.4μM、Taq DNA聚合酶最佳浓度为0.1μL、本方法最小检测菌数为8个。说明用套式PCR的方法提高了检测牛奶中布鲁氏菌的敏感性。     

鸭疫里默氏杆菌16S rRNA和dnaB基因的双重PCR检测方法的建立

为了快速、准确地鉴定鸭疫里默氏杆菌(RA),本实验根据RACH3株16SrRNA和dnaB基因序列设计引物,经引物筛选和PCR反应条件优化后,建立了检测RA的双重PCR方法。结果表明该方法对检测的所有不同血清型RA菌株均能扩增出364bp和627bp两条特异的目的片段,而对鸭致病性大肠杆菌、鸭源禽巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、黄杆菌等对照菌株的扩增结果均为阴性;该PCR方法对细菌HXb2基因组DNA和菌液的检测敏感性分别为17.33ng/mLDNA和2.9×10~3cfu/mL细菌。利用建立的双重PCR检测了RA感染鸭的肝脏和脑组织中的RA,结果显示该方法与细菌分离法符合率分别为100%(9/9)和77.8%(7/9),表明本实验建立的双重PCR方法可用于检测肝脏组织中RA。本研究建立的双重PCR方法既可以对分离的RA疑似菌株进行快速检测和鉴定,也可以直接用于临床样品中RA的检测。     

应用随机PCR技术检测未知病毒基因序列的研究进展

随机引物PCR技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD;arbitrarily primed PCR,AP-PCR)是由Welsh、Williams于1990 年几乎同时建立起来的一项DNA多态检测技术 .该技术以 PCR 为基础,利用一系列单一的人工合成的随机寡核苷酸链为引物,对所研究的基因组DNA 进行 PCR扩增.在该技术问世的短短几年内,因其独特的检测DNA多态性的方式以及简便快速等特点而     

山羊和绵羊嗜血支原体PCR检测方法的建立与应用

为建立羊嗜血支原体(M.ovis)病快速检测方法,本实验根据GenBank中登录的羊M.ovis 16S rRNA基因序列设计一对引物,以山羊和绵羊M.ovis基因组DNA为模板,建立M.ovis PCR检测方法,并进行特异性、敏感性及临床应用试验。结果显示,建立的M.ovis PCR检测方法扩增片段大小为508 bp,与GenBank中M.ovis参考株同源性达99%以上,该方法与猪嗜血支原体、牛嗜血支原体等病原体无交叉反应,最低检测40个拷贝的DNA;通过对延边地区60份山羊和绵羊血液样本的检测结果表明,建立的PCR检测方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于M.ovis的检测。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

本实验建立猪博卡病毒(PBoV)PCR检测方法,并调查当前云南猪群中PBoV的感染情况。在GenBank数据库中对PBoV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增PBoV非结构蛋白NP1基因片段的引物,基于该引物建立PBoVPCR检测方法;用所建立的方法检测发生腹泻猪的粪便,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;以提取的PCV2、大肠杆菌的DNA为模板验证引物的特异性;并用核酸蛋白定量仪定量PBoV阳性样本的DNA,经梯度稀释后取1μL为模板确定所建立的PBoVPCR方法的敏感性;应用建立的PCR方法调查140份2015年云南省部分猪群样品中PBoV的存在情况。本实验建立的PCR方法特异性强,仅能扩增出PBoV,对PCV2、大肠杆菌核酸无交叉扩增现象;灵敏度高,对PBoV的最低可检出DNA浓度为0.1ng/μL;应用建立的PCR方法检测了140份采集自云南省部分地区的粪便样品,结果显示样本中PBoV的检出率为20%(28/140)。实验成功建立了检测PBoV的PCR方法,对云南地区猪群PBoV的临床诊断和流行病学调查等具有参考价值。     

牛布鲁菌病奶液PCR检测方法的建立及初步应用

为探讨以牛奶为材料检测牛布鲁菌感染的可行性,本试验建立了可鉴定布鲁菌属的单重PCR以及可鉴定布鲁菌种的多重PCR.结果显示,单重PCR方法的特异性强,只特异性的扩增布鲁菌DNA,对照菌株大肠杆菌、牛败血性波氏杆菌、根瘤农杆菌和苍白杆菌的扩增结果均为阴性;奶液中细菌检测灵敏度为1.08×104CFU/mL.用建立的多重PCR对7株不同种的布鲁菌体和基因组进行鉴定,表明该方法可以区分不同种布鲁菌.本试验中建立的PCR方法能够鉴定所有致病性布鲁菌并对疫苗株和野生毒株加以区分,适用于实验室布鲁菌的快速鉴定.     

基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法

根据鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的rfbS基因在第237和598位碱基的不同,设计和合成等位基因特异性PCR引物,建立快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门氏菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能特异性地鉴定鸡白痢沙门氏菌,检测灵敏度达18 pg/μL DNA,4.7×10⁴ CFU/mL菌液,表明建立的等位基因特异性PCR方法能准确而快速地鉴定鸡白痢沙门氏菌。     

3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56~59 ℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg²⁺浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10^-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持.     

基于弓形虫529-bp重复序列巢式PCR诊断方法的建立

根据GenBank已发表的弓形虫529-bp重复序列(AF146527)设计巢式PCR引物,建立巢式PCR检测方法.结果表明,该方法能扩增出427 bp的片段,敏感性试验表明该方法可以检测出0.1 pg的弓形虫基因组DNA,敏感性是常规PCR的100倍.巢式PCR方法对蜥蜴利什曼原虫、隐孢子虫、细粒棘球绦虫基因组扩增无条带,特异性强.样品检测符合率达100％.巢式PCR方法的建立为弓形虫病的诊断及流行病学调查提供技术支持.     

针对fimW基因沙门氏菌的特异性PCR检测

为建立沙门氏菌快速检测方法,本研究根据沙门氏菌Ⅰ型菌毛蛋白调控基因fimW设计一对引物,建立PCR检测方法,并对收集的A群～F群14个血清型40株沙门氏菌和5种12株非沙门氏菌菌株进行PCR扩增.结果显示所有沙门氏菌均扩增出与预期(477 bp)相符的特异性片段,而非沙门氏菌扩增结果均为阴性.另外,以肠炎沙门氏菌50336株DNA为模板,敏感性试验结果显示该方法可以检测出扩增体系中1pg DNA染色体和102cfu的沙门氏菌.表明本研究建立了检测沙门氏菌简洁、敏感、特异的PCR方法.     

牛白血病病毒LUX^TM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

采用LUXTM新型荧光PCR技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物.建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA.结果显示所建立的LUXTM荧光PCR/RT-PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应.敏感性实验表明LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高104倍以上.采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品.     

猪圆环病毒3型套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种准确、快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,试验根据GenBank中PCV-3基因序列设计合成了内、外两对引物,建立了套式PCR方法,并检验了该方法的特异性、敏感性、重复性,同时用该方法对124份临床疑似病料进行检测。结果表明:用建立的套式PCR方法检测PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV,均为阴性,外引物PCR扩增的检测灵敏度为17 ng DNA,内引物PCR扩增的检测灵敏度为0. 17 ng DNA。用该方法检测124份临床病料样品,外引物共检测出阳性样品22份,内引物共检测出阳性样品28份,青海省部分地区PCV-3的感染率达22. 58%(28/124)。说明该套式PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可以用于临床病料中低含量PCV-3的快速检测。     

鸡组织滴虫病PCR病原学诊断方法的建立

为建立鸡组织滴虫(H.meleagridis)的PCR检测方法,本研究以确诊的感染火鸡组织滴虫的阳性鸡的肝组织DNA为模板,设计针对18S rRNA基因高度保守的特异性引物,建立组织滴虫病的PCR诊断方法。敏感性试验显示阳性样品组织DNA的最低检出限为4 ng/μL。特异性试验表明与其他常见鸡寄生虫的DNA样品均无交叉反应。该PCR方法对临床样品的检出率为100%,与组织病理学诊断结果符合率为100%。该诊断方法敏感、特异,可以用于组织滴虫病的临床诊断。     

应用PCR检测山羊痘病毒

初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中山羊痘病毒的PCR方法。试验设计了2对引物，用以分别检测山羊痘病毒的特异性基因和α-微管蛋白基因。克隆到的DNA扩增产物的序列与GenBank中收录的序列同源性达到98％。试验表明，用PCR方法可快速检测样品中的山羊痘病毒。     

羊源产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α,β,ε,ι毒素基因序列,设计并合成4对特异性引物,经过优化多重PCR反应条件,建立了检测产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而对诺维氏梭菌和腐败梭菌扩增为阴性;灵敏性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0,17.8,12.2,13.8,18.5pg;重复性试验表明,该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测出9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本试验建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。     

动物源性食品中弓形虫Nested PCR-RFLP分子检测技术的建立

目的为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分序列,找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段,设计套式PCR两对引物,以UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为模板,初步建立了检测两种虫体的Nested PCR技术。将纯化的Nested PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中,经鉴定、测序并进行同源性分析。结果Nested-PCR的外、内引物对两种虫体rDNA基因均能进行扩增,长度分别在800~900 bp、400~500 bp之间。内引物扩增DNA序列与公布的同种虫体DNA序列同源性较高,弓形虫和新孢子虫分别达99.1%、97.2%,但它们两者之间差异较大,同源性仅为86.6%。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切位点,挑选内切酶进行RFLP实验,结果表明新孢子虫NestedPCR扩增片段能被Vsp1酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和敏感性试验,实验证明该Nested PCR能对弓形虫和新孢子虫rDNA基因进行特异性的扩增,而对其它原虫基因未能扩增出任何片段;该Nested-PCR能检测出100个弓形虫速殖子/g猪肉。结论本实验建立Nested PCR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫,而且能明确区分弓形虫和新孢子虫。     

奶牛乳房炎中大肠杆菌PCR检测方法的初步建立

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的一种主要细菌.为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,本试验以大肠杆菌为主要研究对象,根据已发表的致病性大肠杆菌16-23S rRNA特异性序列设计并合成一对引物,对昆明市的某发生奶牛乳房炎的病牛的牛奶进行大肠杆菌PCR检测,并对扩增片段进行序列分析,建立一种直接从牛奶中检测大肠杆菌的PCR快速诊断方法.结果表明,该方法能够检测到乳样中的大肠杆菌,而且具有快速、准确和特异的优点.