携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株表达载体的构建

PCR扩增山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55的TK（Thymidine kinase）基因作为侧翼序列;用XhoⅠ/NotⅠ消化含有报告基因的质粒pLSEG得到痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）p7.5启动子调控大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（E.coli.gpt）作为报告基因;人工合成VV I1L启动子用于调控表达外源基因,用Overlap PCR的方法将VV I1L启动子和VV p7.5启动子调控的gpt连接但使两启动子转录方向相背,并在VV I1L启动子下游引入XhoⅠ位点作为外源基因的插入位点,构建成表达载体元件I1L-P7.5-GPT。将I1L-P7.5-GPT插入TK基因的Acc65Ⅰ位点,构建成表达载体。将构建的载体转染山羊痘病毒G14-STV44-55株感染的羔羊睾丸细胞,用含有霉酚酸（Mycophenolic acid,MPA）等筛选试剂的培养基筛选重组山羊痘病毒（rGTPV）。结果显示,构建成以TK基因为侧翼、以VV I1L启动子调控目的基因,以gpt为报告基因的表达载体pGEM-TK-I1L-GPT,成功筛选到表达gpt的rGTPV,rGTPV至少可稳定传代15代。结果表明,构建了我国山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株的表达载体;TK基因是GTPV G14-STV44-55疫苗株的复制非必需区,以TK基因为插入位点获得的重组病毒可稳定传代15代以上。     

山羊痘病毒非必需基因区gp024基因的鉴定

为筛选山羊痘病毒(GTPV)的外源基因插入区,本研究以GTPV Pellor株为模板,设计2对引物,PCR扩增AV 41株GTPV_gp024基因相邻上下游长度约1.1 kb的同源重组片段,分别插入质粒pGPT-EGFP中.插入部位在痘病毒双向启动子p11～p7.5启动的报告基因EGFP-GPT上下游,构建转移载体pEG024,并转染已感染GTPV Av 41病毒的LT细胞,经GPT加压筛选7代后得到重组病毒.结果显示,重组病毒稳定表达报告基因EGFP,从而表明GTPV_gp024基因能够作为外源基因的插入区.     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

布鲁菌OMP25基因重组山羊痘病毒的构建

将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游,构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞,在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化,经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。     

共表达AsiaⅠ型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因重组山羊痘病毒的构建及鉴定

将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因与启动绿色荧光蛋白双向串连痘苗病毒启动子相连,以KpnⅠ为插入位点,将整体基因片段插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建共表达重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P12A3C。与疫苗弱毒株山羊痘病毒共转染BHK21细胞,经绿色荧光筛选,RT-PCR检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株vTK-3CP1-GFP。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

伪狂犬病病毒gD、gE基因的克隆及转移载体的构建

利用PCR扩增了伪狂犬病病毒Min-A株gD、gE基因,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.将gD、gE基因连接于质粒pUC18获得pUgDgE,缺失质粒pUgDgE的BamHI和BstEII位点间391bp的片段.在此缺失位置插入来自质粒pcD-NA3.1-的一段含hCMV启动子、多克隆位点和Neo报告基因的片段,构建了通用转移载体pgD-M-gE.该转移载体缺失了伪狂犬病病毒gI基因和gE基因ORF5'端363bp的碱基,有11个酶切位点可供外源基因的插入,上下游侧翼分别为1.25bp和1.42bp.这为开发以伪狂犬病病毒为载体的多价基因工程疫苗提供了有力工具.     

山羊痘病毒SS株5个ANK基因缺失的重组病毒构建

为研究锚定蛋白基因(Ankyrin,ANK)对山羊痘病毒的影响,试验采用融合PCR和Overlap PCR技术扩增山羊痘病毒SS株5个ANK基因(ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145)两端侧翼序列和绿色荧光蛋白(GFP)基因,并将其产物连接Trans1-T 1载体构建ANK缺失的转移载体,经过菌液PCR以及质粒双酶切鉴定,阳性重组质粒用Lip 2000转染至已经感染羊痘病毒SS株的羊睾丸原代细胞,依报告基因GFP的表达情况在荧光显微镜下筛选目的基因缺失的重组病毒,同时设立不感染病毒的对照。结果表明:通过融合PCR方法成功扩增山羊痘病毒SS株ANK基因010和138的两端侧翼序列及GFP基因片段,大小约1200 bp;通过Overlap PCR方法成功得到ANK基因140、141.2和145基因的侧翼及GFP基因片段,大小约900 bp,与理论相符。研究成功构建了基因缺失转移载体,将其转染感染SS病毒的细胞中,5个ANK基因缺失的表达载体均可见绿色荧光斑点,说明得到各自基因缺失的重组羊痘病毒。