浅谈猪繁殖障碍与呼吸综合症的控制

引起猪繁殖障碍与呼吸综合症的病毒，属披膜病毒科动脉炎病毒组成员，为RNA病毒，可以在原代猪肺泡巨噬细胞、CL2621细胞系及MarC-145细胞系上生长繁殖，而且其基因组表现出非常的易变性，目前对PRRS病毒的起源还不清楚，仍未有既安全效果好的疫苗，不同的PRRS病毒分离株对猪的致病力也存在差异，目前研究的结果表明，猪是唯一的     

第七章PRRS病毒感染的诊断

由于PRRS病毒感染的临床症状与其它病毒性或细菌性病原感染的临床症状相似,因此PRRS病毒感染的确诊需要进行实验室诊断。目前可用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清病毒中和(SVN)试验和间接荧光抗体(IFA)检测。这些试验的阳性结果只能表明猪曾经自然感染或接种过该病毒的疫苗,而不能判断猪是否仍旧感染。其它可用的检测方法实际上是确定该病毒是否存在,这些方法包括:免疫组织化学染色(Immunohistochemistry Staining,IHC)、荧光抗体染色法(Fluorescent Antibody Staining,FA)、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和病毒分离(VirusIsolation,VI)。虽然阳性检测结果能说明样本中存在病毒,但阴性检测结果并不一定说明被检猪没有感染病毒。正确地选择并处理样本、检测方法的敏感性都有助于提供可靠的检测结果。没有任何一种血清学检测方法可以区分猪感染的是PRRS病毒野毒株或疫苗株。病毒的基因测序可以预测PRRS病毒两种毒株之间的亲缘关系以及它们与疫苗株之间密切性。基因测序不能预测某一种疫苗是否能成功预防这种疾病。限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP或"切割模式")作为PRRS病毒的一种诊断手段价值有限。由PRRS血清学阳性母猪所产的仔猪,在3～16周龄前血清学检测仍会保持阳性。转阴的确切时间因母猪阳性的水平以及所采用的血清学试验类型的不同而异。由于猪体内的PRRS病毒抗体不能终生存在,一般建议青年猪(而非种猪)应进行监测,以确定猪群的PRRS病毒感染状态。     

重组白细胞介素-2提高PRRS抗体阳性猪的猪瘟疫苗免疫效果试验

观察了重组白细胞介素-2（IL-2）对健康成年猪和PRRS抗体阳性猪的猪瘟疫苗免疫效果的影响。结果显示,重组IL-2和猪瘟疫苗一起免疫健康猪,20d后间接血凝抗体滴度达到1∶64的猪的比例为87.5％,而不注射IL-2的对照组抗体滴度可以达到这一水平的比例只有25％。给经2次猪瘟疫苗免疫但抗体滴度在1∶32以下的PRRS抗体阳性猪单独注射IL-2,20d后,注射前检测不到抗体的猪都检测到了抗体,注射前抗体滴度在1∶8～1∶16之间的猪的抗体滴度提高到1∶32～1∶64。再次用猪瘟疫苗和IL-2共同免疫,可使抗体滴度提高4倍以上。而不注射的对照组抗体滴度则略有下降。说明重组IL-2可以减轻PRRS感染所引起的免疫抑制,提高猪瘟疫苗的免疫效果。     

1株牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定

在对进口种用奶牛隔离检疫期间,从1头IBRV中和抗体阳性奶牛中分离出1株病毒。该分离株表现类似于IBRV特征的细胞病变,细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞。用特异性抗IBRV阳性血清与其进行中和试验,发现IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为27,与IBRV标准株的中和抗体滴度相差不到1个滴度。用OIEV推荐的IBR特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,表明分离到的病毒为IBRV。     

从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究

采用猪肺巨噬细胞和Marc-145细胞培养对国内暴发流行PRRS的某地猪场进行了病毒分离,从流产胎儿分离出特征性致细胞病变因子。用PRRSV SDOW-17单克隆抗体进行间接免疫荧光染色,证明从4头流产胎儿分离出4株PRRSV(CH-la,CH-lb,CH-lc,CH-ld)。这4株毒均可在猪肺巨噬细胞和Marc-145细胞上生长,并产生特征性CPE变化。用PRRSV美国分离毒株VR-2332和NVSL抗血清分别对4株CH-1、VR-2332和NVSL毒株感染细胞进行间接免疫荧光试验,结果表明4个CH-l毒株近似于美洲型PRRSV。间接免疫荧光试验证明,4个CH-l分离株与HCV、PrV、PPV、TGEV、PEDV和HEV无交叉抗原。本文首次报道在国内暴发生殖和呼吸道综合征猪群分离到PRRS病毒。     

PRRSV云南株的分离与鉴定

从云南某猪场采取病料经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)阳性,将其处理后接种到猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞上。接种后3 d,猪肺巨噬细胞开始出现细胞病变(CPE);Marc-145细胞盲传3代后,细胞也出现了CPE。对出现CPE的细胞培养物,用RT-PCR法、间接免疫荧光试验进行检测,结果均为PRRSV阳性;细胞培养物经PEG初步浓缩后,接种到PRRSV阴性,PRV、CSFV抗体阳性的仔猪,15 d后猪只出现体温升高并伴有食欲减退,精神不振等症状。采血并用同上的RT-PCR法检测,结果为阳性;采血用同上的RT-PCR法检测,结果亦为阳性;用电镜对纯化后的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,其直径约为50 nm;间接免疫荧光实验可见黄色荧光;TCID50测定其毒价为10-4.75/0.1 mL。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化(pH5.0或pH7.5)和热敏感;结果表明,已成功分离获得一株PRRSV云南地方流行毒株,命名为YN-1。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒F株的分离鉴定

2012年2月,潍坊某猪场疑似发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。病猪主要表现为呼吸困难,耳朵发绀,皮肤有弥漫性出血点;剖检发现淋巴结、肺脏出血严重。从病死仔猪脾、肺、淋巴结和脑组织中分离得到病毒。将该毒株在Marc-145细胞上盲传3代出现典型细胞病变,F3代病毒滴度为106.5TCID50/mL。RT-PCR检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性。用F3代毒株进行动物回归试验,结果符合高致病性PRRSV致病特征。上述结果证明该猪场发生的传染病为高致病性PRRS,并且利用Marc-145细胞成功分离到高致病性PRRSV,命名为F株。本研究为高致病性PRRSV致病特点及其疫苗研制提供物质基础。     

从进口种用奶牛中分离传染性牛鼻气管炎病毒

在对2865头进口种用奶牛隔离检疫期间,从1头IBR中和抗体阳性奶牛中分离1株病毒。该分离株表现类似于IBR病毒特征的细胞病变(CPE),细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞,有时会发现有几个细胞核的巨大细胞。用特异性抗IBRV阳性血清与之进行中和试验,发现IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为26.5,与对IBR标准株的中和抗体滴度相差不到一个滴度。调取IBRVLA株gB基因序列,设计出1对IBR特异性的引物进行PCR,能扩增出与目的基因片段大小一致的特异性条带。结果表明:分离到的病毒为IBRV。     

猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究进展

1991年,荷兰中央兽医研究所Wensvoort博士用原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)首次分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),并命名为Lelystad病毒(PRRSV欧洲型代表株).次年,美国科学家Collins和Benfield等用CL2621细胞也分离到一株PRRSV并命名为VR-2332(PRRSV美洲型代表株).PRRSV属于尼多病毒目(Nidovimles)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员.     

浒苔水煎提取物对PRRSV抑制作用研究

通过Marc145细胞体外培养研究浒苔水煎提取物(Enteromorpha decoction,ED)对猪繁殖呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的抑制作用。结果与仅接种病毒的对照组相比较,25%~50%浓度的ED对PRRSV均有显著抑制作用;ED处理Marc145细胞1、2、3 h均能显著降低PRRSV的滴度,三者之间差异不显著;ED对0.1 MOI和0.01 MOI接种量的病毒抑制作用无显著性差异;持续作用于Marc145细胞,ED可完全抑制PRRSV的增殖;PRRSV接种前用ED处理Marc145细胞较接种后ED处理更显著地降低了病毒滴度。细胞毒性试验显示,50%ED对Marc145细胞有轻微损伤作用,45%以下浓度则无损伤。     

对鸡群A/B亚群禽白血病病毒抗体ELISA检测阳性率的可靠性评估

为了评估某些批次的禽白血病病毒（ALV）抗体商品化 ELISA检测试剂盒在检测鸡群中A/B亚群禽白血病病毒（ALV-A/B）抗体阳性率的可靠性,使用同一批次试剂盒,对往年ALV-A/B抗体检测阳性率达标（＜1%）的A类鸡场及往年ALV-A/B抗体检测阳性率不达标（＞1%）的B类鸡场所送检样品进行初检,在A类鸡场初检阳性样品中挑选S/P值最高的8份阳性样品,在B类鸡场初检阳性样品中挑选S/P值最高的40份样品,再使用相同批次的试剂盒将每个初检阳性样品做3个孔的重复检测,并以上述48份样品为一抗同时做间接免疫荧光试验（IFA）,系统比较了IFA和ELISA 2种方法检测结果的一致性。结果发现,A类鸡场初检为阳性的8份样品经复检和IFA检测均变为阴性;B类鸡场4份样品（4/40）ELISA复检和IFA结果均变为阴性,36份样品（36/40）ELISA复检仍为阳性,但其中20份呈IFA阳性,16份呈IFA阴性,结果表明某些批次的试剂盒在特异性和稳定性方面存在一定问题。提示,相关企业在进行大批量样本检测时,ELISA阳性样品需结合IFA进行结果判定,以提高检测的准确性。     

重组M蛋白-乳胶凝集试验检测PRRS病毒血清抗体的研究

利用纯化的 PRRS病毒重组 M蛋白致敏乳胶制成乳胶抗原 ,成功地建立了一种检测 PRRS病毒血清抗体的乳胶凝集试验 (L AT)诊断方法。用制备的乳胶 M抗原分别检测猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪弓形体病、猪衣原体病、猪乙型脑炎阳性血清 ,结果均为阴性 ,无交叉反应 ,说明建立的 L AT方法具有良好的特异性。用建立的乳胶凝集试验方法与国外IDEXX公司 PRRS病毒抗体检测试剂盒同时对 76份猪血清样本进行检测 ,结果表明建立的 L AT方法的特异性和敏感性均为 95 % ,两种方法的总符合率为 87% ,检出率基本一致。研究结果表明 L AT方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点 ,是一种适合基层兽医单位用于 PRRS病毒血清抗体检测的新方法     

稳定转染CD151或CD163的Marc145细胞系的建立及其在PRRS疫苗生产中的应用

为了进一步探讨提高PRRSV感染靶细胞滴度的有效方法,本研究采用脂质体介导方法,通过G418筛选稳定转染Marc145细胞,并利用单个细胞克隆技术,获得了稳定超表达CD151蛋白和(或)CD163蛋白的Marc145细胞株,经免疫荧光化学和Western Blot鉴定证实,成功表达出基因重组猪CD151蛋白和CD163蛋白。在GMP生产车间将超表达CD151、CD163蛋白或CD151/CD163蛋白共表达的Marc145细胞感染PRRSV,使病毒感染滴度提高了10倍以上。将上述收获的病毒液制备了灭活苗,疫苗效力超过部颁标准。     

猪繁殖与呼吸综合征诊断技术研究进展

1991年，荷兰中央兽医研究所Wensvoort博士用原代猪肺泡巨噬细胞（PAM）首次分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），并命名为Lelystad病毒（PRRSV欧洲型代表株）。次年，美国科学家Collins和Benfield等用CL2621细胞也分离到一株PRRSV并命名为VR-2332（PRRSV美洲型代表株）。PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivims）成员。     

青岛地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查与病原分离鉴定

本文对不同地区209份血清进行了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的普查,以检查该病的阳性率.共检出113份阳性,阳性率在43%～82%之间,平均为64%;在感染猪群中,通过细胞培养技术分离到一株猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒,利用免疫荧光抗体试验(IFA)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)电镜观察等技术进行了鉴定.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc-145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-6.5TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50~70 nm。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的PRRS临床症状和死亡。结果表明,成功分离到一株PRRSV。     

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】 试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】 采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验（IFA）和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】 抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应（CPE）。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066（LC367318.1）相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2（MN937506.1）相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】 试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。     

云南省楚雄地区猪蓝耳病抗体水平调查

为了了解猪蓝耳病(PRRS)在楚雄地区散养户和规模化猪场中的免疫水平情况,从楚雄9个地区随机采集了230份血清样品,采用间接ELISA方法对血清样本进行PRRS抗体检测。结果显示,230份血清样品中,阳性数为160份,总体阳性率为69.6%,其中,抗体弱阳性样本89份,占38.7%,抗体强阳性样本71份,占30.9%。     

怀孕后期感染PRRS病毒母猪所产新生仔猪的免疫反应

将PRRS病毒BJ－4株感染怀孕后期（约90天）的抗体阴性和阳性母猪，待自然分娩后，观察新生仔猪的免疫应答。结果显示，接种PRRS病毒BJ－4的母猪没有表现出明显的临床症状，没有出现流产死产。新生仔猪浦被子前血清中PRRS病毒核酸TR－PCR检测和ELISA抗体阴性，哺乳后特异性抗体出现，5－6周母源抗体逐渐下降；20日龄猪瘟疫苗免疫后疫苗抗体维持时间短，仔猪在40日龄后进入野毒感染的危险期。RT－nested PCR检测血清中PRRS病毒核酸和易感仔猪病毒特异性抗体监测的结果提示仔猪群内可能存在水平传播。流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群发现CD3^ 细胞减少，CD4^ 细胞显著下降，CD8^ ，CD4^ CD8^ 和SLA－DR^ 表达细胞升高。以上结果表明在感染后病毒能够长期持续性存在，猪场内新生仔猪母源抗体逐渐下降后，通过水平传播受到感染，感染后免疫应答受到不利影响。     

四种试剂盒检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗体的对比试验

使用国产的4种猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体ELISA诊断试剂盒(VP1-ELISA)、猪口蹄疫O型液相阻断ELISA检测试剂盒(LB-ELISA)、猪口蹄疫正向间接血凝试剂盒、猪O型口蹄疫病毒ELISA抗体检测试剂盒(O-ELISA)同时检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后的50份血清样品,阳性率分别为98.0%、94.0%、54.0%、90.0%。同时使用农业部规定的3种试剂盒分别检测20份血清样品的抗体滴度发现,VP1-ELISA试剂盒和LB-ELISA试剂盒阳性符合率为95%,平均抗体滴度相差0.7,与IHA试剂盒符合率为55%,平均抗体滴度相差3.8,故LB-ELISA试剂盒可以用来评价合成肽疫苗免疫的抗体,而IHA试剂盒不能用来检测合成肽疫苗免疫的抗体。