基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样，采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量，再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样，检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度，定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性，比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明，检测灵敏度过低，会降低高并样率检测的准确性；阳性率在30%以上时，高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好；高载量感染的阳性率不低于6.7%时，50∶1以内的并样能准确得出检测结果；低载量感染的阳性率不低于16%时，25∶1以内的并样能得出较好结果；高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果；各种并样模式均有很好的诊断特异性，50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近；各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围，二者存在极显著相关性，各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

用于水生病原菌的3种高通量活菌计数方法的比较

以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为研究对象，比较了MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数，确定了上述3种方法在副溶血弧菌活菌计数的标准曲线和线性范围。结果显示，副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT产物甲瓒在555 nm的吸光度(OD555 nm)为计数依据，活菌数的对数(LgC)与LgOD555 nm线性关系的标准曲线为LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，相关系数R²=0.9965，线性检测范围为7.8×106~2.5×108 CFU/ml；ATP生物发光法以ATP产生的相对发光度值(RLU)为计数依据，LgC与LgRUL线性关系的标准曲线为LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，相关系数R²=0.9994，线性检测范围为1.0×104~3.0×108 CFU/ml；高通量生长曲线法以生长曲线达到拐点的时间(Ts)为计数依据，LgC与Ts线性关系的标准曲线为LgC=?(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572)，相关系数R²=0.9924，线性检测范围为1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3种方法对实际菌液测量并与平板计数法比较表明，ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性，MTT比色法准确度稍差，而高通量生长曲线法有最宽的线性范围，也最适合高通量测定。     

盐度对暗纹东方鲀幼鱼生长及摄食的影响

为研究盐度对暗纹东方鲀幼鱼生长和摄食的影响,将暗纹东方鲀幼鱼在盐度分别为0、10、17、26、40的水体中饲养6周,比较不同盐度下幼鱼存活率、特定生长率、摄食率和饲料系数的差异。结果表明:当盐度为40时,暗纹东方鲀幼鱼的死亡率为100 %;各盐度组的特定生长率无显著差异;幼鱼的摄食率随着盐度的增高而下降。在淡水环境中,暗纹东方鲀幼鱼的摄食率最高,达5.02 %;在高盐度水体中最低,为3.75 %。暗纹东方鲀幼鱼的饲料系数随着盐度的升高逐渐升高,淡水组和26盐度组与10、17盐度组有显著差异。     

SPF鸡感染J亚群禽白血病病毒血清抗体与卵黄抗体的变化动态及其相关性

为研究以卵黄抗体替代血清抗体判定SPF鸡群J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染状态的可行性,人工接种ALV-J的SPF鸡23周龄时,分别从25只抗体阳性鸡及22只抗体阴性鸡采集血清和卵黄,比较不同稀释度的卵黄与血清中ALV-J抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄1∶400稀释,假阳性和假阴性最少,确定1∶400为卵黄最适稀释度。对40只攻毒SPF鸡和36只同批次单独饲养的空白SPF鸡在25~34周龄,每隔3周采集一次血清,每周采集一次种蛋,共采集304份血清样品和760份卵黄样品。血清按1∶500稀释,卵黄按1∶400稀释,所有血清和卵黄抗体用美国IDEXX公司ALV-J抗体ELISA检测试剂盒检测,同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品严格在同一次ELISA中检测。结果显示,在25~34周龄,卵黄抗体检测判定结果与血清整体吻合率为82.5%~95%。上述结果表明用卵黄抗体替代血清样品检测来监控SPF鸡群对ALV-J的感染状态是可行的,疫苗生产企业可通过抽检SPF鸡场提供SPF种蛋的卵黄抗体水平来判断SPF鸡场的洁净度。     

IFA和ELISA检测J亚群禽白血病病毒的比较研究

为比较3种禽白血病病毒(ALV)抗原检测ELISA试剂盒的特异性和灵敏度,将J亚群禽白血病病毒(ALV-J)传染性克隆rNX0101株以病毒原液(9×103TCID50)、10倍病毒稀释液(9×102TCID50)、100倍病毒稀释液(90 TCID50)接种培养于6孔板的DF1细胞,每孔均提前放入灭菌的细胞爬片,于接种后第1~6天每天取上清用3种ELISA试剂盒(A、B、C)检测ALV p27抗原,同时在接种后的第3天和第6天取出细胞爬片进行间接免疫荧光法(IFA)检测。结果表明,IFA方法对高、中、低剂量接种3 d后均可检出ALV-J的感染,而ELISA试剂盒中只有A试剂盒在高剂量接种时才能检出,试剂盒B和试剂盒C最早要在第4天才可检出;中、低剂量接种,3种试剂盒在第4~5天才能检出;第6天时,由于病毒的明显复制,无论IFA方法还是3种ELISA试剂盒都可检出ALV-J的感染。本研究结果为正确选择商品化禽白血病抗原检测试剂盒提供了借鉴。     

2016～2017年中国沿海省市虾类偷死野田村病毒(CMNV)分子流行病学调查

偷死野田村病毒(CMNV)引起的病毒性偷死病(VCMD)使中国对虾养殖业遭受了严重的经济损失，为查明CMNV及其变异株的分子流行病学特征，本研究采用逆转录套式PCR (RT-nPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)和TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR) 3种方法，对2016~2017年中国沿海省市CMNV及一种新型野田村病毒——行动障碍野田村病毒(MDNV)的流行、分布和变异情况进行了分析。结果显示，养殖凡纳滨对虾、中国明对虾、日本囊对虾、斑节对虾和罗氏沼虾等种类中均可检测到CMNV阳性；在河北、山东、浙江、福建、广东和海南等省市采集的患病对虾中均存在CMNV。基于RT-nPCR、RT-LAMP和TaqMan RT-qPCR的检测结果显示，2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率依次分别为11.8%和7.8%，6.7%和3.9%，17.7%和12.4%；基于上述3种方法检测结果计算得出，2016和2017年样品中CMNV的阳性检出率分别为26.8%和16.3%；基于RT-LAMP的分析显示，2016年样品中MDNV的阳性检出率为9.4%。本研究表明，中国沿海省市养殖虾类中VCMD的流行和危害仍不容忽视，RNA依赖的RNA聚合酶基因不断变异导致前期基于该基因开发的CMNV检测方法可靠性下降，检出假阴性风险升高；同时，发病对虾中出现了新的野田村病毒株系且具有较高的流行率，其传播危害风险值得高度关注。     

江苏高邮罗氏沼虾池塘养殖可培养微生物组成调查

为了探明罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)池塘养殖环境中重要微生物的组成, 以提升健康养殖管理技术, 分别于 2019 年 7 月、8 月和 10 月, 在江苏高邮市罗氏沼虾主养区开展了罗氏沼虾池塘养殖系统可培养环境微生物的组成调查。采用 LB 培养基分离纯化了罗氏沼虾肝胰腺、肠道、鳃及养殖水体中可培养的细菌, 利用细菌 16S rRNA 基因分子鉴定技术对分离菌株进行初步鉴定; 采用高通量测序技术分析了“铁壳”虾(养殖期生长缓慢)及铜绿微囊藻暴发池塘水环境微生物群落组成。以达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)为受试病原菌, 分析了池塘养殖系统中潜在病原拮抗菌的种类及效果。3 次调查共分离可培养细菌 605 株, 成功鉴定 601 株, 分别属于 37 个属 119 种, 其中罗氏沼虾体内分离到菌株 23 属 76 种, 养殖水体中分离到 28 属 81 种。确定了池塘养殖系统中存在气单胞菌(Aeromonas spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)等属的潜在病原菌。发生“铁壳”虾症的虾池优势环境微生物种类组成及占比与健康虾池相近, 但微小杆菌属(Exiguobacterium)与不动杆菌属(Acinetobacter)细菌占比高于健康虾池。铜绿微囊藻暴发影响环境微生物的组成结构, 嗜水气单胞菌属细菌占比增大。从池塘养殖系统筛选到甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、贝莱斯芽孢杆菌 (B. velezensis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)等潜在益生菌对气单胞菌具有较强拮抗作用。调查结果可为掌握罗氏沼虾池塘养殖系统细菌性病原组成及建立防控技术提供理论依据。     

凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析

对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量,用Taq Man q PCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。结果显示,在主要生长相关参数中,RZ群体最优,该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异,HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布,而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布,代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中,各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺中肠血淋巴鳃肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P0.001);除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外,其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P0.01)或显著(P0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示,肝胰腺是主要的EHP感染组织,其他组织中杂交信号较弱,但各组织中有少数细胞的EHP易感。     

凡纳滨对虾感染致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的定量分析

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirAVp和PirBVp毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×105 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pirAVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirAVp,其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值, 为8.71×104 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×103、2.59×104、5.76×104 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现VpAHPND的富集,在高死亡发生期,VpAHPND数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的VpAHPND均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的VpAHPND水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的VpAHPND数量呈下降趋势。研究表明,在VpAHPND感染过程中,组织中的pirAVp基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中VpAHPND的数量不一定处于高水平状态。     

“一带一路”背景下中亚油气合作的前景及建议

“一带一路”沿线国家是中国国际能源合作的重要区域,中亚地区是“一带一路”油气合作的核心区,经过20多年的投资与合作,形成了集石油与天然气全产业链、油公司业务与工程技术服务业务有机结合、中国能源企业国际化与当地化相融合的示范合作区。基于“一带一路”沿线油气合作必要性及其已取得成绩,重点研究了中国与中亚地区合作的潜力、面临的风险,建议政府持续优化“五通”政策,打造能源丝绸之路与能源区域命运共同体,能源企业要积极适应新变化、创新商业模式,不断提升国际化能力。