基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样，采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量，再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样，检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度，定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性，比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明，检测灵敏度过低，会降低高并样率检测的准确性；阳性率在30%以上时，高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好；高载量感染的阳性率不低于6.7%时，50∶1以内的并样能准确得出检测结果；低载量感染的阳性率不低于16%时，25∶1以内的并样能得出较好结果；高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果；各种并样模式均有很好的诊断特异性，50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近；各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围，二者存在极显著相关性，各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

环境条件对1株假交替单胞菌脱氮效果的影响

从对虾养殖池中分离得到1株具有高效脱氨氮能力的菌株(2906)，根据菌株2906的16S rRNA序列分析，该菌与假交替单胞菌属Pseudoalteromonas tetraodonis的亲缘关系最近，命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)2906。利用不同C/N、pH、盐度的脱氮培养基，分析了环境条件对该菌株脱氮效率的影响，研究了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乳糖和可溶性淀粉等不同碳源对菌株2906脱氮效果的影响。结果显示，菌株2906在C/N为15~20、pH为7~8、盐度为5~15时，具有良好的脱氨氮效果。应用柠檬酸钠为碳源，氨氮去除率达100%。在脱氮培养过程中，细菌生长与脱氮效率呈强相关性(相关系数R=0.94)。采用浸泡攻毒方法测试了该菌对幼虾的生物安全性，结果显示，该菌对幼虾的LC50为2.8?107 CFU/ml，表明该菌对对虾不具致病力。研究结果可为该菌的开发利用提供技术支持。     

抗弧菌杀鱼假交替单胞菌2515的潜在毒性及热处理脱毒后抗菌效果

为评估一株具有弧菌拮抗功能的杀鱼假交替单胞菌2515 Pseudoalteromonas piscicida 2515 (以下简称"菌株2515" ) 对海水养殖动物的毒性, 并确定一种有效的热处理脱毒方法, 在中国明对虾Fenneropenaeus chinensis育苗水体中分别添加浓度为105、 106、 107、 108 CFU/mL的菌株2515, 测试其对中国明对虾受精卵孵化及幼体发育的影响.结果表明: 水体中添加浓度高于105 CFU/mL的菌株2515后, 显著降低了无节幼体变态发育至蚤状幼体的成活率 (P<0. 05); 分别应用血平板及显微观察法测试菌株2515对羊、鱼及对虾血细胞的溶血活性, 结果显示, 该菌对羊及鱼红细胞均具溶血活性, 而对凡纳滨对虾 Litopenaeus van-namei血细胞无溶血活性; 设置不同温度 (40、 45、 50、 55、 60、 65、 75℃) 热处理菌株2515及其破碎液,结果显示, 55 ℃ 1 h能够灭活该菌, 且失去对鱼类红细胞的溶血活性, 而抑菌物质活性可提高55. 8%.研究表明, 菌株2515对鱼虾具有潜在毒性, 选择适当热处理, 既能灭活溶血活性还可提高抗菌活性.     

罗非鱼循环水养殖系统中一株肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其脱氮性能研究

实验从山东德州市一罗非鱼(Oreochromis niloticus)养殖场循环水养殖系统的脱氮池中分离到一株具有高效脱氮特性的菌株(编号DZYC02),分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠为碳源,研究了碳源种类对菌株DZYC02脱氨氮效果的影响;同时以蔗糖为碳源、NH4Cl为氮源,研究了不同碳氮比、初始pH及盐度对该菌株脱氮效果的影响。结果显示:菌株DZYC02在以柠檬酸钠为碳源、C∶N≥15、pH 5~7、盐度0~15的条件下具有良好的脱氮效果,24 h内对浓度为20 mg/L的NH+4的去除率达100%,48 h内对浓度为20 mg/L的NO-2去除率高达100%;将该菌采用浸泡方式感染斑马鱼(Danio rerio)进行生物安全试验,结果显示菌株DZYC02对斑马鱼表现出较好的安全特性。分别用Biolog细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行鉴定,结果显示菌株DZYC02为一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。     

一对虾养殖场的多病原跟踪

本研究通过对一对虾养殖场定期采样，采用分子生物学鉴定方法，分别对对虾体内及水环境中弧菌(Vibrio sp.)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)及主要病毒性病原进行了跟踪检测，同时，检测了水环境中的氨氮及亚硝基氮含量的变化趋势。结果显示，该对虾养殖场中存在的主要病原为多种致病弧菌和EHP，未检测出对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、偷死野田村病毒(CMNV)及传染性皮下和造血组织坏死病毒(IHHNV)；该养殖场中弧菌检出种类达到16种，其中，主要的弧菌种类有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌 (V. alginolyticus)、欧文氏弧菌(V. owensii)、创伤弧菌(V. vulnificus)、哈维氏弧菌(V. harveyi)，且存在导致急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VPAHPND)；养殖中期大棚养殖池水体氨氮及亚硝氮浓度分别达到(3.5±2.0)、(8.2±0.7) mg/L，显著高于室外养殖池水体氨氮及亚硝基氮浓度(P<0.05)。养殖期跟踪的7个虾池中，出现严重对虾病害的大棚养殖池比例达到100%，而室外养殖池仅出现轻度对虾病害，发病池比例为25%。根据研究结果推测，造成大棚养殖池对虾发病死亡的主要原因为养殖对虾感染弧菌及虾肝肠胞虫，同时，养殖密度大、水体氨氮及亚硝基氮浓度过高等在对虾病害发生中起到了协同作用。本研究结果可为当前对虾养殖病害防控技术提供理论支持和科学依据。