转BtCry3A基因杨树毒蛋白表达及对桑天牛抗性的研究

为探索转抗虫基因(BtCry3A)741杨对鞘翅目昆虫的抗虫性,以7个转基因株系为检测对象,从分子生物学检测、毒蛋白的表达以及抗虫性检测等方面对转抗虫基因(BtCry3A)741杨株系进行了比较分析。7个转基因株系的DNA经PCR扩增显示,已转入BtCry3A基因。不同时期测定转基因株系不同部位叶片的毒蛋白含量不同,5月份测定的毒蛋白含量在当年生枝条不同部位叶片中未表现出明显的差异,至9月份封顶前,毒蛋白含量明显降低,且顶部叶片含量显著高于中下部叶片。在枝条的木质部中,毒蛋白的相对含量明显高于韧皮部。转基因株系对桑天牛幼虫的致死率很低,但对幼虫的发育具有明显的抑制作用。     

转OvBAN/bar双价基因的紫花苜蓿对虫蚀及除草剂的耐受性分析

以"甘农3号"紫花苜蓿为受体,利用农杆菌介导法导入双价基因OvBAN/bar,通过PCR检测和Southern杂交分析表明,4个转基因株系含有目的基因且均出现杂交条带,其中2个株系为单拷贝,1个株系为双拷贝,1个株系为三拷贝;对获得的4株转基因苜蓿进行qRT-PCR分析表明,具有三拷贝数的1个转基因株系OvBAN基因的表达量最高,其次为双拷贝数的2个转基因株系,并且这些株系的花青素还原酶活性及缩合单宁含量均显著高于野生型苜蓿。以过量表达OvBAN基因的3株转基因苜蓿为试验材料,进行抗蚜性和除草剂耐受性分析。结果表明,与野生型苜蓿相比,转OvBAN/bar基因苜蓿对苜蓿蚜都具有较好的抗性,蚜虫抑制率为78%~93%;用0.5%的市售草铵膦喷施各株系,10d后各转基因株系除个别叶片枯萎死亡,其他叶片及茎秆生长状况良好,而野生型苜蓿全部枯萎死亡,表明bar基因已整合到转基因苜蓿基因组中并稳定表达。综上所述,转OvBAN/bar基因紫花苜蓿表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。     

表达Ⅰ型类人胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶α-蛋白的转基因家蚕品系构建

家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。     

杨树木质部特异启动子MDCesAP的改造及功能检测

木质部特异表达的强启动子有助于外源目的基因在植物木质部中高效表达。将2个杨树木质部特异启动子MDCe-sAP串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成pDMDCesAP-GUS植物表达载体,通过农杆菌介导,并采用叶盘法转化烟草,获得烟草抗性植株。β-葡糖醛酸酶(GUS)活性检测结果表明,该串联启动子DMDCesAP具有木质部特异性,有望应用于桑天牛寄主树种的抗虫转基因研究。     

转Cecropin B抗菌肽基因柑橘对溃疡病的离体抗性评价

本文对转Cecropin B抗菌肽基因的锦橙植株进行了表达检测以及柑橘溃疡病病原菌的接菌实验。分别用喷雾法和针刺法进行离体接菌实验，用Real-time PCR和Southern blot进一步检测分析了在转基因植株中Cecropin B基因的表达、整合情况。结果显示与喷雾法相比，针刺接种处理的离体叶片开始显症时间短，且发病率高，便于统计分析。针刺接种6天后，大部分转基因株系发病率与非转基因植株无显著差异，其中，PR8、PR11、AAT8 和AAT14株系的发病率分别为67%、63%、68%和54%，显著低于非转基因植株。Real-time PCR表达分析结果表明,转基因株系中Cecropin B基因表达量明显高于对照株系。Southern blot结果显示PR8和AAT14株系中转基因为单拷贝， PR11和AAT8株系中转基因分别为两个拷贝和三个拷贝。实验结果表明转Cecropin B抗菌肽基因提高了对柑橘溃疡病的抗性。     

转基因动物研究及其在医药和畜牧业上的应用

动物转基因技术一种是将外源基因转移到动物受精卵中,使其整合和表达,以产生具有新遗传特性的动物;另一种是将外源基因在特定调控元件作用下,在一定时间内表达外源蛋白。而转入的外源基因通常有4类:参与编码和调节机体组织生长发育的基因;与动物生产力密切相关的经济性状的主效基因;培育出抗某些疾病或具有广谱抗病性品系的抗性基因;治疗人类疾病所需的蛋白基因[1,2]。     

我国转基因鸡初露端倪

由上海复旦大学和上海新杨种畜场共同投资 2 0 0万元创建的上海复旦新杨生物科技有限公司 ,在全国率先开发通过鸡蛋蛋清表达外源基因的技术。他们构建了能在鸡蛋蛋清中表达外源基因的表达载体 ;建立了有效的转基因技术 ,转基因效率在 3 0 %至 70 %之间 ;2 0 %以上的转基因鸡所产的鸡蛋蛋清中检测到实验用的外源基因“人瘦素蛋白” ,其中最高的表达量为每升蛋清中含 1 0毫克至 3 0毫克。鸡转基因技术开发前景深远 :①改良鸡的种质品质 ,可培育出生长速度快、抗病毒、低胆固醇蛋的转基因品系。②利用鸡蛋蛋清作为生物反应器 ,在蛋清中生产有药…     

转PRL基因小鼠遗传性状分析

本研究以原核注射法生产的乳腺特异性表达PRL基因小鼠为模型,从外源基因遗传完整性、拷贝数和插入位点3方面对其进行遗传性状分析,为今后大型转基因动物的选育提供基础。采用基因组DNA PCR方法筛选发生外源基因片段部分缺失的小鼠,并进行Southern blot验证,以检测外源基因的遗传完整性;用绝对荧光定量PCR方法测定外源基因拷贝数,用Genome walking方法分析外源基因整合位点。结果显示,外源基因片段部分缺失率为1.91%;整合十几个拷贝外源基因的小鼠在便携UV灯下可见绿色荧光,整合2个拷贝的小鼠无绿色荧光;在NW_001073945.1序列的2 025~2 026bp和NW_001030574.1序列的10 760 020~10 760 021bp处插入的外源基因可正常表达。以上结果说明,外源PRL基因在原核注射法生产的转基因小鼠中可稳定遗传;在一定范围内,外源基因的表达量与拷贝数呈正相关;附近无其他基因的外源基因插入位点有利于外源基因的表达。     

抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究

利用基因重组技术,将木霉几丁质酶基因(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)进行融合并将其引入含bar基因的载体pAHC25中,成功构建了由Ubiquitin启动子分别驱动Chi-linker-Glu和bar的中间载体,然后将其上的Ubi-Chi-linker-Glu-nos和Ubi-bar-nos表达盒引入pBI121中,获得兼具除草剂抗性基因bar和真菌抗性基因Chi与Glu的三价植物表达载体pBIb-CG,并对烟草进行遗传转化,经PCR及Southern检测,共获得转基因烟草32株。外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗性。     

转基因动物细胞中外源基因整合位点的分析

旨在通过测定转基因动物中外源基因在宿主染色体上的整合位点来阐述外源基因的整合机制及对该过程中出现的有关问题进行讨论。本研究以MYF6(Myogenic factor 6)转基因小鼠及FAT-1转基因牛为试验材料,采用TAIL-PCR(热不对称交互式PCR)、hiT AIL-PCR(高效热不对称交互式PCR)及本试验室改进的hiT AIL-PCR法,对转基因动物进行了外源基因的整合位点的检测及测序分析。本研究检测到3个MYF6转基因小鼠和一个FAT-1转基因牛的外源基因插入到染色体上的片段,还获得了大量的未能整合到染色体上的PCR片段。通过对以上片段的测序分析,我们发现重组质粒并不一定是在酶切位点断裂,重组质粒可以发生随机断裂,首尾相连等,外源基因整合如宿主染色体,可以同源重组的方式进行整合,也可以进行随机插入。同时,发现并分析了在转基因动物检测中可能存在的问题。通过对外源基因在转基因动物体内整合位点的分析,能够明确转基因动物的遗传背景,能够为转基因动物的生产提供帮助。     

几个杨树木质部特异启动子片段表达载体的构建与功能分析

木质部纤维素合酶基因(CesA)在植物正常生长期的木质部特异表达,受到外界压力时可诱导在韧皮部表达,因而被用作杨树抗桑天牛转基因研究中的特异性表达启动子。将前期分离的CesA上游DNA片段JCesAP、YCesAP和MDCesAP分别替换植物表达载体pCAMBIA1302中的组成型启动子CaMV35S,构建成新的植物组织特异性表达载体pJCesAP-GFP、pYCesAP-GFP和pMDCesAP-GFP,然后采用农杆菌介导法转化烟草,均得到完整的再生烟草植株。经PCR初步检测证明目的基因已整合到烟草基因组中。荧光检测JCesAP、YCesAP和MDCesAP片段均能启动GFP蛋白的表达,在395 nm激发光下出现黄绿色荧光,显示3个CesA片段均具有在木质部特异表达的启动子活性。     

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道菌群结构及优势菌群,获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛成虫肠道中提取细菌基因组DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物27F/1495R和27F/519r+GC进行V3可变区PCR扩增,将长约500 bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后,进行优势条带分析、DNA回收、克隆、测序等,初步得到分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的8个细菌菌株,其中优势细菌为克雷伯氏菌属的细菌菌株,其次是沙雷氏菌属的细菌菌株。将获取的细菌16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析,相似度在97%以上的有6个菌株,其中有5个菌株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致,表明基于16S rDNA的PCR-DGGE技术可用于桑天牛肠道菌群多样性研究。     

Technical development for production of gene-modified laboratory rats

Transgenic rats have been used as model animals for human diseases and organ transplantation and as animal bioreactors for protein production. In general, transgenic rats are produced by pronuclear microinjection of exogenous DNA. Improvement of post-injection survival has been achieved by micro-vibration of the injection pipette. The promoter region, structural gene, chain length and strand ends of the exogenous DNA are not involved in the production efficiency of transgenic rats. Exogenous DNA prepared at 5 microg/ml seemed to be better integrated than lower and higher concentrations. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) has been successfully achieved in rats using a piezo-driven injection pipette. The ICSI technique has not only been applied to rescue infertile male strains but also to produce transgenic rats. The optimal DNA concentration for the ICSI-tg method (0.1 to 0.5 microg/ml) is lower than that for the conventional pronuclear microinjection. Production efficiency was improved when the membrane structure of the sperm head was partially disrupted by detergent or ultrasonic treatment before exposure to the exogenous DNA solution. For successful production of transgenic rats with a modified endogenous gene, establishment of embryonic stem cell lines or alternatively male germline stem cell lines and technical development of somatic cell nuclear transfer are still necessary for this species.     

几株桑天牛成虫肠道优势细菌的分离与鉴定

为了研究桑天牛成虫肠道微生态环境,探索破坏桑天牛营养利用等功能的生物防治新途径,对健康桑天牛成虫肠道的优势细菌进行分离鉴定。选择平皿上出现3个以上的菌落作为肠道优势细菌进行分离纯化,共获得6个菌株。6个菌株均呈杆状,革兰染色和氧化酶反应均呈阴性,在25～35℃、pH 5.5～9.5的环境中生长良好,但各菌株的菌落形态及多种生化性状有差异。通过菌体形态观察、染色反应、生理生化特征分析及16S rDNA碱基序列测定与同源性分析,鉴定1、2、3号菌株分别为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),4、5、6号菌株分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)。     

食品级重组产朊假丝酵母菌的构建及其遗传稳定性测定

旨在构建食品级酵母工程菌株,并对其遗传稳定性进行评价。采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)方法,将实验室已构建完成的原核表达载体PGZM18中的原核基因序列删除,设计2组引物,以PGZM18原核载体序列为模板进行引物设计,将片段序列分为2个片段P1-1和P2-1,通过重叠延伸PCR技术删除来自原核的DNA序列(包括抗药性标记Amp在内的细菌质粒序列DNA片段及原核复制区),将最终获得的PCR产物GZM18转化至产朊假丝酵母中,通过菌落计数和PCR方法测定外源基因遗传稳定性。结果表明,食品级产朊假丝酵母工程菌株构建成功,外源基因具有较高的遗传稳定性。研究结果为产朊假丝酵母工程菌在微生物饲料开发方面的应用提供了科学依据。     

副猪嗜血杆菌血清7型菌株毒力及耐药性分析

【目的】了解河南地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清7型流行菌株的毒力及耐药情况。【方法】以Hps血清7型参考菌株为对照,对6株Hps血清7型临床分离菌株进行16S rRNA基因扩增、序列分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究。【结果】16S rRNA基因测序及相似性比对结果显示,菌株1436与参考菌株0007相似性为100%,菌株1565、1624与参考菌株0007相似性均为98.6%。系统发育树分析表明,菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近;菌株1624与参考菌株0007亲缘关系最远。6株临床菌株与参考菌株表现为2种毒力基因型,菌株均携带有vta1、vta2、vta3、wza、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因,其中5株临床菌株还携带ompP2毒力基因。豚鼠致病性试验结果显示,临床菌株毒力较参考菌株表现出不同程度的增强,参考菌株不能感染豚鼠发病,未表现任何临床症状;临床菌株可感染豚鼠发病,表现出一定的临床症状,发病率为20%~40%,死亡率为0。参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感,对强力霉素、氟苯尼考中介,对新霉素、卡那霉素、阿米卡星、红霉素、替米考星等耐药,且均表现出多重耐药现象。【结论】Hps血清7型临床菌株有一定的致病性,但毒力较弱,对头孢类药物敏感,有明显的多重耐药现象,临床上应注意对该血清型的防控。本研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础,为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据。     

鸡传染性支气管炎病毒华南分离株核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ）核蛋白基因序列,设计并合成 １ 对引物。应用这对引物,以 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 特异性扩增出华南分离株（ Ｈ Ｎ 株）的核蛋白基因,基因产物大小为 １５ ｋｂ , 与设计相符。对 Ｈ Ｎ 株部分核蛋白基因进行序列测定,并与标准毒株 Ｈ５２、 Ｍ ４１、 Ｂｅａｕ 和 Ｇｒａｙ 的核蛋白基因进行同源性比较,结果表明, Ｈ Ｎ 株与 Ｈ５２、 Ｍ ４１、 Ｂｅａｕ 和 Ｇｒａｙ 株的核酸同源性分别为 ８５％ 、８４％ ８４％ 和 ８６％ 。由此可以看出, Ｈ Ｎ 株与标准毒株在核蛋白基因上存在一定的差异。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在转基因烟草中的初步表达

将鸡传染性法氏囊病病毒TS株VP2基因置于植物组成型表达启动子CaMV 35 S之下,构建了IBDV VP2基因的表达载体pBR-VP2,经根瘤农杆菌介导法将VP2基因整合到烟草基因组中,Northern杂交结果表明,转基因烟草中存在IBDV VP2基因的mRNA;Dot-ELISA和Western blotting检测表明IBDV VP2基因在烟草中得到了表达.