基因型鹅副粘病毒NA-1株全基因组的克隆及特性分析

将本实验室分离保存的NA-1株鹅副粘病毒(GPMV)经SPF鸡胚增殖,收集鸡胚尿囊液进行病毒纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的GPMVZJ1株基因组序列,设计了8对特异性引物,RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒各基因片段,并将各目的基因片段回收纯化,克隆PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒选取阳性克隆酶切鉴定并进行序列测定,对测定结果进行拼接得到全长cDNA序列(GenBank登录号:DQ659677)。NA-1株核苷酸比新城疫病毒(NDV)核苷酸多6个碱基,位于1644~1645nt之间,符合NDV核苷酸“六碱基原则”。序列分析结果表明,GPMVNA-1株与各地代表株核苷酸同源性81.2%~91.3%。同时根据各毒株F基因开放阅读框前389个核苷酸序列绘制出系统发育进化树,结果表明GPMNNA-1株与SF02和QY97病毒株同属于基因型,不同于基因IX型NDV的国家标准株F48E9和基因型的LaSota传统弱毒株。     

猪源副黏病毒JL-1株全基因获得及遗传变异分析

利用本实验室分离保存的猪源副黏病毒JL-1株来提取病毒基因组RNA.参考GenBank发表的相关禽副粘病毒Ⅰ型(Avian paramyxovirus serotype 1,APMV-1)基因组序列,设计了8对特异性引物,RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒各基因片段,并将各目的基因片段回收纯化,将纯化后的PCR产物进行测序.测定结果得到NP、P、M、F、HN、La、Lb、Lc 8段基因序列,利用DNAMAN软件进行拼接得到基因组全长cDNA序列(GenBank登录号:EU546165).序列分析结果表明,PPMV JL-1株与各地代表株核苷酸同源性87.85%～99.78%,与鹅源新城疫(GPMV)ZJ-1、NA-1株核苷酸同源性分别为83.31%、83.46%,同时根据各毒株F基因开放阅读框前389个核苷酸序列绘制出系统发育进化树,结果表明PPMV JL-1株与LaSota同属于基因Ⅱ型,不同于基因Ⅶ型的ZJ-1和NA-1株的鹅源毒株.     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株(La Sota等)的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段(登录号:JF950510.1)设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDVF基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉致病指数(IVPI)判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列(登录号:JF950510.1)设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

两种禽源新城疫病毒分离株F基因遗传变异分析

以鸡胚分离结合血清学鉴定,从近几年江苏省及河南省分离到来自鸡和鸽子的6株新城疫病毒(NDV).病毒蚀斑纯化后,选取3个克隆利用RT-PCR技术扩增F基因重要功能区片段,在对PCR产物直接序列测定分析基础上,选取一致克隆株进行全长F基因克隆、序列测定分析.根据分离株序列与GenBank中NDV相关毒株序列比较分析,结果表明,所分离的6个分离株归属为3个NDV基因型,其中有基因VIId亚型(3株)、基因VI型(2株)和基因Ⅱ型(1株).这6株NDV的F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,属于NDV强毒株典型序列.     

"拯救"NA-1株鹅源副黏病毒辅助质粒的构建及鉴定

将本实验室保存的NA-1株鹅源副黏病毒（GPMV）经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液进行病毒纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的ZJ1株GPMV基因组序列,设计了4对特异性引物,利用RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒NP、P和L基因片段,并将目的基因片段消化、回收纯化,克隆pCI-neo表达载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒选取阳性克隆酶切、PCR鉴定并进行序列测定,结果表明NP、P和L基因正确克隆到pCI-neo表达载体中,并分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。将构建好的pCI-NP、pCI-P和pCI-L重组质粒单独转染Vero细胞,在荧光显微镜下观察到特异绿色荧光,表明NP、P和L蛋白得到成功表达。     

鹅源禽副粘病毒NA-1株HN蛋白基因的遗传变异研究

鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。     

新城疫病毒山东流行株F基因的序列测定和分析

用 SPF鸡胚从发生新城疫鸡群分离到一株病毒 ,进行了生物学特性的研究 ,结果表明 ,最小致死量鸡胚平均死亡时间 (MDT)为 5 0 ,1日龄鸡脑内接种致病指数 (ICPI)为 1.82 ,6周龄鸡静脉接种致病指数 (IVPI)为 2 .6 2 ,属强毒力毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组 RNA,RT- PCR扩增其融合蛋白 F基因重要功能区片段 ,经回收后 ,克隆到 p GEM- T载体上进行酶切鉴定与核苷酸序列测定 ,并与多株已报道的 NDV国内外参考株相应片段进行序列比较 ,F基因的同源性在 84% - 91%之间 ,氨基酸同源性为 82 % - 93% ,经基因进化树分析 ,证实流行株为基因 型毒株     

鹅源I型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特性分析

根据GenBank中鸡新城疫病毒（NDV）基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源I型禽副粘病毒（AMPV-1）或NDV JG97株的F基因。将扩增片段克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定。该片段含1个完整的、长1662bp的F基因开放阅读框（ORF）,编码的F蛋白长553个氨基酸,其中含有12个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸顺序为^112R-R-Q-K-R-F^117,与NDV强毒株特征相符。同源性分析表明,JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97株的核苷酸和蛋白氨基酸的同源性分别为94．6％-99．6％和96．6％-99．5％,与LaSota株的核苷酸和氨基酸的同源性仅为84．6％和88,8％。结果表明JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97等5个毒株的遗传关系较近,而与LaSota株差异较大。     

广东鸽禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型的分离鉴定

2007年在广东某发病鸽群中分离到一株鸽禽Ⅰ型副黏病毒（GM01）．经测定,其鸡胚平均死亡时间（MDT）为76h,鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1．3,在鸡和鸡胚上为中等毒力病毒。应用RT—PCR对F基因片段进行扩增并测序,结果表明该F蛋白裂解位点处氨基酸序列为112R—R—Q—K—R—F 117,是典型的强毒株序列。用DNASTAR软件对GM01株F基因片段与国内外相关的NDV参考株进行比较,结果表明GM01株与Chicken／Gx／14／2005株的核苷酸和氨基酸相似性分别为98．6％和98．4％;与Pigeon-Gxp40毒株核苷酸和氨基酸相似性分别为98．5％和98．7％,在遗传进化树中位于同一个分支,同属于基因Ⅶ型;与国内代表性弱毒疫苗株LaSota毒株和NDV强毒株F48E9的核苷酸及氨基酸相似性分别为84．1％和86．5％及86．3％和88．0％。     

广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析，为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考，也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotypeI，APMVx）基因组序列，设计了1对特异性引物，用RT—PCR法分别扩增出病毒各F基因片段，并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明，从猪组织中分离获得1株猪源禽I型副粘病毒，分离株F基因112～117住裂解住点的氨基酸组成为R—R—Q－R—R-F，与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明，分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87．5％和87．4％。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株，属于基因I型是传统型毒株，广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。     

鹅源Ⅰ型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特性分析

根据GenBank中鸡新城疫病毒(NDV)基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源Ⅰ型禽副粘病毒(AMPV-1)或NDV JG97株的F基因.将扩增片段克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定.该片段含1个完整的、长1 662 bp的F基因开放阅读框(ORF),编码的F蛋白长553个氨基酸,其中含有12个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株特征相符.同源性分析表明,JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97株的核苷酸和蛋白氨基酸的同源性分别为94.6%～99.6%和96.6%～99.5%,与La Sota株的核苷酸和氨基酸的同源性仅为84.6%和88.8%.结果表明JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97等5个毒株的遗传关系较近,而与La Sota株差异较大.     

西北地区新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

从西北地区（陕西、甘肃、青海和新疆）1979～1999年发生新城疫鸡群中共分离和收集了15个毒株,经蚀斑纯化、SPF鸡胚增殖得到9株NDV分离株。致病力测定结果表明,除2株为中强毒外,其余均为强毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组RNA,RT－PCR扩增基融合蛋白（F）基因N端908bp的片段,经回收、鉴定后,克隆到pGEM-T载体上进行核苷酸序列测定。对各毒株核苷酸及推导的氨基酸进行序列和同源性的比较,结果表明所有毒株在该区段没有缺失和插入,但有多处碱基置换。各分离毒株之间同源性很高（平均96．8％）,与疫苗毒株同源性较低（82．5～85．8％）,而分离自青海省的3个毒株与其他毒株的同源性均较低（平均88．0％）。以389bp核苷酸绘制系统发育树,证实西北地区的新城疫是由基因型Ⅶc和一个新发现的基因型Ⅸ引起的。     

新城疫病毒（青岛株）F蛋白基因的克隆和序列分析

参考新城疫病毒（NDV）长春株的F基因序列设计了1以特异性引物，应用RT－PCR对NDV青岛株（野毒）的F基因进行了扩增，扩增产物克隆后测序，扩出的F基因核苷酸长度为792bp，编码261个氨基酸，包括完整的F2片段和部分F1片段，裂解位点区（112－117aa）氨基酸序列为Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe，与国外发表的强毒株序列相符，正明青岛株为强毒株，根据该基因推导的所基酸序列，与国内外发表的NDVF蛋白氨基酸序列相比，同源性为88．1％－94．3％。     

2003年～2006年东北地区新城疫病毒部分分离株分子遗传学特征

本研究从2003年-2006年我国东北地区收集的疑似新城疫病毒感染的鸡源病料中,分离鉴定出12株可在鸡胚成纤维细胞上产生病变的新城疫病毒,并对其进行了蚀斑纯化。应用RT-PCR方法扩增含病毒融合蛋白基因47nt～420nt片段,并进行序列测定及分析。结果表明,12株NDV分离株F蛋白裂解位点序列均为^112R-R-Q-K-R-F^117。重要中和位点、糖基化位点及半胱氨酸残基高度保守。与GenBank中30株NDV参考毒株F基因序列比较和分析后,发现12株NDV分离株均为基因VIId亚型毒株,为我国目前优势流行毒株;与不同地区及宿主来源的参考毒株比较的结果表明本次分离于东北地区的毒株没有明显宿主及地域特征。     

两株鸽源新城疫强毒株的分离鉴定及分子特性分析

从山东地区疑似新城疫病毒(NDV)感染鸽群中分离到两株新城疫病毒分别命名为pigeon/China/bz12和pigeon/China/bz11,经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为76.6 h、78.8 h,1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)分别为1.98、1.95,符合NDV强毒特征.设计NDV F基因特异性引物,使用RT-PCR从纯化后鸡胚尿囊液中扩增获得了约1 662 bp基因条带,序列测定确认为NDV F基因,其氨基酸一级结构包含553位氨基酸残基,F0蛋白裂解位点含112-RQKRF-117氨基酸序列,具有NDV强毒株分子特性.依据yellow基因序列同源性对获得2株NDV分离株和42株NDV参考毒株基因型分型,结果显示,2株鸽源NDV分离株都属于基因Ⅶ型,其与基因Ⅶ型NDV不同分离株同源性达93.5％～99.8％,与鸡源强毒NDV分离株Chicken/China/SD8/2010同源性高达99.8％,表明这两株鸽源分离毒株可能来源于感染的鸡群.     

鹅源副粘病毒NA-1株F蛋白基因的克隆及其载体的构建

鹅源副粘病毒分离株 NA- 1经 1 1日龄鸡胚增殖后收集尿囊液 ,浓缩 ,提取病毒基因组总 RNA,采用 RT- PCR方法 ,一次性扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯回收后克隆入 p MD1 8- T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,对阳性克隆进行了序列测定和序列分析。测序后拼接的 F基因长 1 6 72 bp,包含完整的开放阅读框 ( 1 6 6 2bp) ,编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R- R- Q- K- R- F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。根据 NDV基因分型标准 ,鹅源副粘病毒 NA- 1株归属基因 型 NDV。将 F基因克隆入转座载体 p Fast Bac ,得到重组转座载体 PFF,将 PFF转化大肠杆菌 DH1 0 Bac,提取质粒 ,得到阳性重组穿梭载体 re- Bacm id,为下一步的转染表达奠定了基础     

鸡马立克病病毒814株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析

从感染鸡马立克病病毒血清Ⅰ型(MDVⅠ)814株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取病毒总DNA,以其为模板,根据GenBank中MDVⅠ GA株基因组gE、gI、gp82基因序列,设计并合成3对特异性引物,用PCR方法分别扩增了814株的gE、gI、gp82基因,并将扩增的基因片段克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,应用DNA Star软件分析814株gE、gI、gp82基因核苷酸序列,并与已发表的MDVⅠ毒株序列进行了比较.结果表明,不同MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因同源性很高,814株与已发表的MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因核苷酸序列同源性分别在99.4%、98.9%和99.6%以上.     

新城疫病毒TL1株P基因的克隆及序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒P基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的P基因进行了扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-Teasy载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。测序拼接得出P基因的序列长度为1248bp,该基因的ORF总长为1188bp,编码395个氨基酸。与GenBank下载的12株参考毒株比较P基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.8%,氨基酸的同源性为99.2%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为96.1%,氨基酸的同源性为95.5%,说明TL1株和与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因VII型新城疫病毒。而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为83.4%,氨基酸的同源性81.8%,说明该毒株相对于经典的NDV在P基因上已发生了较大的变异。