仙台病毒核蛋白的原核表达及鉴定

本研究从一株鼠仙台病毒（Sendai virus,SeV）中扩增获得核蛋白（nucleocapsid protein,NP）基因,将其克隆入pET32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。将原核表达产物作为免疫原,免疫BALB/C小鼠,制备获得抗NP的特异性多抗,经间接免疫荧光法和Western blot法检测,该表达产物原具有良好的免疫原性。将该产物纯化作为包被抗原,建立了一种检测SeV感染的间接ELISA方法。通过H1N1流感病毒、H9N2流感病毒、新城疫病毒阳性血清进行交叉试验表明：该间接ELISA方法有很好的特异性。这为实验动物仙台病毒抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒快速核酸检测方法

为加强口岸对进境野生及实验用啮齿类动物中淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）筛查和流行病学调查,本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速高通量检测LCMV的方法,证实两种核酸检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,适于快速检测LCMV。     

狂犬病病毒快速荧光RT-PCR检测方法研究与应用

采用TaqMan方法,根据古典狂犬病病毒非编码区及N基因编码区序列,设计合成多对引物和多条探针,通过对引物、探针的筛选,反应条件的选择和优化,建立了古典狂犬病病毒荧光RT-PCR检测技术。与病毒分离鉴定、常规RT-PCR试验比较表明,建立的荧光PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内。特异性试验表明本方法与犬瘟热病毒,犬细小病毒,犬Ⅰ型腺病毒不发生交叉反应。初步动物感染试验及定量检测研究及表明,本方法可用于感染动物不同组织样品中病毒的相对定量。对132份临床样品和4种商品化疫苗进行检测研究表明,本方法适用于样品中狂犬病病毒的直接检测以及疫苗中活病毒或灭活病毒的检测。     

兔病毒性出血症病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的RHDV VP60基因序列,设计合成内外2对引物,优化PCR反应条件,建立了检测RHDV的巢式RT-PCR方法。该方法对兔轮状病毒、仙台病毒、健康兔肝脏组织的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是10 ng,第2次扩增的敏感性是0.1 ng,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。建立的巢式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速检测出极低含量的RHDV,将为兔病毒性出血症的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、简单、高效、特异、灵敏的检测方法。     

犬瘟热病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立犬瘟热病毒(CDV)的一步法RT-PCR检测方法,并将其应用于临床实践检测。本研究根据GenBank上已登录的CDV基因序列,设计一对特异性引物,建立CDV一步法RT-PCR检测方法,并将该方法应用于临床检测。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于CDV感染的早期诊断和病原监测。     

SYBR Green I荧光RT-PCR法检测H5亚型禽流感病毒

用2株不同致病力的H5亚型禽流感病毒(AIV)感染Madin-Darby canine kidney(MDCK)细胞,收集感染后6,12,24,48,72 h的病毒,提取总RNA,利用Rotor Gene RG3 000实时定量PCR仪对H5亚型AIV的HA基因进行检测,试图建立快速检测H5亚型AIV的real-time RT-PCR方法,并用所建立的方法对来自全国各地的疑似H5亚型AIV的病料和咽喉拭子、泄殖腔拭子346份进行检测。结果表明：农业部动物流感重点开放实验室建立的HA基因的teal-time RT-PCR方法可以检测到细胞培养物中和临床样品中是否含有H5亚型AIV,与常规RT-PCR比较,该方法更加特异、准确、快速。     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

TaqMan~T-PCR对水疱性口炎病毒的鉴定检测

水疱性口炎分为印第安那型 ( Indiana)和新泽西型 ( New Jersey)。这两种血清型病毒的快速和可靠的鉴别对该病的诊断、检疫、分子流行病学调查和监测至关重要。文章按照 VSV核蛋白基因序列 ,设计了一对两型通用引物和两型各自特异性探针。研究建立了 VSV实时荧光定量 PCR检测方法 ,对 VSV细胞培养物、人工感染实验动物组织、血清样品 ,以及系列稀释的不同 TCID50 样品、其它相关或相似病毒进行鉴定 ,同时与常规 PCR、病毒分离试验作了比较。Taq Man○R RT-PCR的特异性和敏感性相当于或优于对照方法。重复性和稳定性试验证实 ,该方法可靠。每个试验中设立阳性、阴性对照和标准稀释度对照 ,使试验结果可对病毒 RNA作准确定量 ,并可在 4h内获得结果。研究结果表明 ,Taq Man○R RT-PCR方法是一种特异性强、敏感性高、快速安全的定量检测方法。因此 ,可以作为 VSV的快速检测和定型。     

H6亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

为快速检测临床样品中的H6亚型禽流感病毒(AIV),本研究通过分析流感数据库中H6亚型的HA基因,在HA保守区设计一对引物,建立一种用于扩增H6亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,扩增片段为327bp.采用该方法对H6亚型AIV的尿囊液10倍倍比稀释样品进行检测,结果显示最低检出量为102.5 EID50/mL.用该方法检测其他亚型AIV和鸡新城疫病毒等病原均为阴性,具有良好的特异性.对H6AIV人工感染鸡的咽喉、泄殖腔棉拭子样品进行一步法RT-PCR检测,并与病毒分离进行比较,显示该方法对棉拭子的检测极限可达102.5 EID50/mL,同时利用该方法及病毒分离对临床样品进行检测,两者检测结果一致.实验结果表明该RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性,可以应用于临床样品的实验室检测.     

贵州省某猪场猪瘟病毒感染的诊断

为弄清贵州某猪场猪发病死亡的原因,采用流行病学调查、临床症状观察、病理解剖诊断、猪瘟抗体快速金标检测卡检测和RT-PCR检测核酸确诊等方法,对该猪场发病猪进行了诊断。实验结果表明:流行病学调查、剖检病理和猪瘟抗体快速金标检测卡检测初步诊断该猪场发病猪疑似猪瘟病毒感染,RT-PCR检测核酸确诊为猪瘟病毒野毒感染。     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

Persistent infection and immunologic tolerance are important characteristics of bovine viral diarrhea disease, which have caused great difficulties on the diagnosis, quarantine and prevention of the bovine viral diarrhea virus (BVDV), so a fast and efficient detection method of BVDV is quite necessary. A pair of primers were designed based on the gene sequences of BVDV 5′UTR published in GenBank, then established the Real-time fluorescent quantitative RT-PCR detection method with SYBR Green Ⅰ to detect BVDV. The results showed that the detection method had high specificity, strong sensitivity and good repeatability. Thus, the detection method of the Real-time fluorescent quantitative RT-PCR would provide an effective means for the rapid detection of BVDV and persistent infected animals. It could supplement and perfect the quarantine and diagnostic methods of BVDV.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为10²和10¹ 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。     

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达10²拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

猴嗜T淋巴细胞病毒1型核酸快速检测方法的建立

猴嗜T淋巴细胞病毒l型（Simian T-cell lymphotropic virus type 1,STLV-1）是无特定病原体（SPF）猴必须排除的病毒之一,其潜伏期较长,主要侵害猴的免疫系统。为强化口岸对进出境野生及实验用灵长类动物STLV-1感染情况的监测和流行病学调查,本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR检测STLV-1的方法,并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了确认。     

Use of quantitative real-time RT-PCR to investigate the correlation between viremia and viral shedding of canine distemper virus,and infection outcomes in experimentally infected dogs

We used real-time RT-PCR and virus titration to examine canine distemper virus (CDV) kinetics in peripheral blood and rectal and nasal secretions from 12 experimentally infected dogs. Real-time RT-PCR proved extremely sensitive, and the correlation between the two methods for rectal and nasal (r=0.78, 0.80) samples on the peak day of viral RNA was good. Although the dogs showed diverse symptoms, viral RNA kinetics were similar; the peak of viral RNA in the symptomatic dogs was consistent with the onset of symptoms. These results indicate that real-time RT-PCR is sufficiently sensitive to monitor CDV replication in experimentally infected dogs regardless of the degree of clinical manifestation and suggest that the peak of viral RNA reflects active CDV replication.     

H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.经反应条件优化,本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法.该法特异性强,只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增,对其他H亚型AIV、N亚型AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等病原体的检测均为阴性;该法敏感性好,对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μL.本试验建立的H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异的优点,为H6N1亚型AIV的防控提供技术支撑.