堆型艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为确定堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)早熟株合适的免疫剂量,设立7个早熟株免疫攻虫组、7个母株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,7个早熟株/母株免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1 000、2 000个/羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以1.5×105个/羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以增重、肠道病变记分和卵囊减少率为试验指标。并对早熟株中免疫保护效果较好的2个免疫剂量进行重复试验,免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验,攻虫剂量为2×105个/羽的同源母株。结果显示,免疫期间,各免疫组的增重与不免疫组差异不显著(P>0.05);攻虫期间,早熟株400、600、800、1 000个/羽和母株600、800、1 000个/羽免疫组的相对增重与不免疫不攻虫组差异不显著(P>0.05);肠道病变记分,除2 000免疫组明显低于不免疫攻虫组(P<0.05)外,其余各免疫组虽低于不免疫攻虫组,但与其差异不显著(P>0.05);卵囊减少率,早熟株和母株400～2 000个/羽免疫组均达90%以上,其中600、800个/羽免疫组达97%以上。用早熟株600、800个/羽进行免疫重复试验,两个免疫组攻虫期间的相对增重和肠道病变记分均与不免疫不攻虫组差异不显著(P>0.05),而与不免疫攻虫组差异显著(P<0.05),其卵囊减少率均在88%以上。研究结果表明,该堆型艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力,其中以600、800个/羽的免疫效果更好,可考虑以600个/羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。     

柔嫩艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为了确定柔嫩艾美耳球虫（Eimenatenella）早熟株合适的免疫剂量,本文设立7个早熟株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000个／羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以8×10^4个／羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以存活率、增重、肠道病变记分、血便数量、卵囊减少率为观测指标。对免疫保护效果较好的3个免疫剂量进行重复试验,同时设置商品化球虫疫苗对照组,免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验。结果显示：攻虫后,不免疫攻虫组出现5％死亡,而各免疫组来出现死亡;各免疫组卵囊减少率在61．57％～69．52％;200～2000免疫组的增重与不免疫不攻虫组差异不具备显著统计学意义（P〉0．05）;600～2000免疫组的肠道病变记分和血便数量均明显少于不免疫攻虫组（P〈0．05）。用600、800和1000进行重复试验,三个免疫组攻虫期间均来出现死亡,而不免疫组和疫苗对照组均出现5％死亡;三个免疫组的增重均明显高于不免疫攻虫组和疫苗对照组（P〈0．05）;早熟株免疫组的肠道病变记分和血便数量明显低于不免疫攻虫组（P〈0．05）,而疫苗对照组与不免疫攻虫组的相当（P〉0．05）;卵囊减少率在66.30％-78．75％,高于疫苗对照组的51．82％。结果表明,该柔嫩艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力,其中600、800和1000个／羽的免疫效果均优于疫苗对照组,可考虑以600个／羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。     

鸡巨型艾美耳球虫早熟株免疫效果试验

为确定使雏鸡获得良好免疫效果的最小巨型艾美耳球虫(E.maxima)早熟株接种量,分别于4日龄对免疫攻毒组以不同剂量进行首免,11日龄以首免2倍剂量对二次免疫攻毒组鸡进行二免。一次或二次免疫后7 d或10 d用同源亲本株进行攻毒,检测免疫攻毒鸡相对增重率、卵囊减少率、病变记分减少率(RLS)和抗球虫指数(ACI)。结果显示,一次免疫剂量≥400个孢子化卵囊/只或两次免疫的一免剂量和二免剂量≥100个孢子化卵囊/只和200个孢子化卵囊/只时,各免疫攻毒鸡的相对增重率≥85%,RLS≥70%,卵囊减少率≥75%,相对保护率≥90%,ACI≥170,均达到良好免疫效果。故将E.maxima早熟株的一次免疫最小免疫剂量定为400个孢子化卵囊/只,两次免疫最小免疫剂量定为一免100个孢子化卵囊/只和二免200个孢子化卵囊/只。     

鸡堆型艾美耳球虫早熟株的最小免疫剂量研究

为确定堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)早熟株的最小免疫剂量,设立了6个早熟株1次免疫组、6个早熟株2次免疫组、2个空白对照组、2个攻毒组。SPF鸡4日龄时以200、300、400、500、600、1 000个/羽的剂量接种早熟株卵囊进行第1次免疫,于14日龄使用1次免疫2倍的剂量进行第2次免疫。一次/二次免疫组及各不免疫攻虫组分别于18或28日龄以2×105个/羽的同源强毒株进行攻毒,以相对增重率、病变记分、病变记分减少率、卵囊抑制率和抗球虫指数(ACI)等指标评价免疫效果,确定最小免疫剂量。结果显示,本次试验使用的早熟株具有良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发雏鸡产生保护力,且随着免疫剂量的增加保护力逐渐提高。一次免疫剂量为1 000个/羽和二次免疫的首次免疫剂量大于等于400个/羽、第二次免疫800个/羽,可达到良好免疫效果,可分别定为E.acervulina早熟株一次免疫和二次免疫的最小免疫剂量。     

鸡胚接种毒害艾美耳球虫Eimeria necatrix的免疫研究

给15、17、19日胚龄的鸡胚经羊膜腔分别接种不同剂量的毒害艾美耳球虫Eimeria necatrix孢子化卵囊、孢子囊或子孢子,出雏后在无球虫环境中笼养,收集2~7日龄间全部粪便,以饱和盐水漂浮法检查卵囊的产生,并于17日龄时以1.2×105个/鸡的同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、病变计分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果表明,孢子化卵囊、孢子囊或子孢子经羊膜腔免疫接种后对鸡胚的孵化率无明显影响,所有接种组在出雏后2~7日龄间均能检获后代卵囊,攻虫后各免疫组的相对增重率由攻虫对照的38%~42.9%提高到73.2%~90.5%,病变计分减少率达50%~74.9%,相对卵囊产量为攻虫对照组的28.1%~60.2%,表明以一定剂量的E.necatrix孢子化卵囊、孢子囊或子孢子经羊膜腔免疫接种鸡胚,可诱导鸡在出雏后笼养条件下对同源艾美耳球虫的免疫保护力;比较不同剂量、不同胚龄的免疫效果,发现在试验设定条件下于17日胚龄接种8×104个子孢子/胚的效果最好。     

3株鸡巨型艾美耳球虫抗原性分析

本研究对3株鸡巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)福建株、上海株和广东株进行免疫原性分析,其中广东株属于早熟株。将7日龄雏鸡分别免疫3株E.maxima孢子化卵囊,12 d后分别攻击相同剂量的同源及异源虫株孢子化卵囊,设不免疫攻虫对照组和不免疫不攻虫对照组,17d开始收集粪便直至无卵囊排出为止,每日计数卵囊,计算卵囊相对减少率。结果:雏鸡免疫后以同源虫株攻击,保护率均在98%以上,而雏鸡免疫后以异源虫株攻击,其交叉保护率在40.78%⁷2.37%之间。提示:E.maxima对同源虫株的保护率明显高于对异源虫株的保护率,说明各分离株间抗原性存在差异。     

布氏艾美耳球虫（Eimeria brunetti）早熟虫株的免疫原性及毒力

用５００卵囊／只剂量的Ｅｂｒｕｎｅｔｉ早熟虫株经口服免疫３日龄公鸡雏后１４ｄ,再以４５×１０４卵囊／只剂量的亲本毒株口服攻毒。结果,免疫雏鸡受到完全保护,其平均增重与空白对照组差异不显著。当免疫剂量为２５０卵囊／只时,仅对攻毒具有部分保护作用。毒力试验结果表明,Ｅｂｒｕｎｅｔｉ早熟虫株的致病力显著低于Ｅｂｒｕｎｅｔｉ强毒虫株。当感染剂量相同时,早熟虫株感染组的平均增重与强毒虫株感染组差异显著或极显著。由此认为,Ｅｂｒｕｎｅｔｉ早熟虫株是一弱毒虫株,可用于鸡球虫弱毒疫苗的制备。     

巨型艾美耳球虫山西早熟株诱导及生物学特性研究

本研究采用早熟选育技术，诱导选育出1株与已获得的山东株免疫原性差异较大的巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)山西株的早熟弱毒株，并对其进行生物学特性研究。结果表明：早熟诱导获得的巨型艾美耳球虫山西早熟株卵囊略小于亲本株，潜隐期为109 h;早熟株各组小肠病变记分差异显著低于(P<0.05)亲本株组，且临床症状较亲本株组弱；等剂量下，早熟株组的卵囊产量及卵囊繁殖力低于亲本株组；早熟株单次免疫剂量≥400个卵囊/只、2次免疫的一免剂量≥100个卵囊/只、二免剂量≥200个卵囊/只时可达到良好免疫效果。本研究结果为制备高效广谱、免疫原性良好的鸡球虫疫苗提供虫株和理论依据。     

堆形艾美耳球虫早熟株选育及相关生物学特性研究

为了选育堆形艾美耳球虫（Eimeria acervulina）早熟株及观测其生物学特性,运用Jeffers创立的艾美耳属球虫早熟株选育方法,对实验室保存的堆形艾美耳球虫进行连续传代早熟选育,并对获得的早熟株与母株孢子化卵囊大小、繁殖能力、致病性以及免疫保护力等指标进行了测定,比较堆形艾美耳球虫早熟株与母株之间的基本生物学特性差异。经过18代早熟选育后,堆形艾美耳球虫的潜在期由母株的99h缩短至84h。与母株相比,早熟株的孢子化卵囊大小明显减小（P〈0．05）,卵囊繁殖能力降低了17％～42%。致病性试验中,早熟株感染组的平均增重均高于母株,而病变记分相当。免疫保护试验中,早熟株与母株的免疫保护力相当,其卵囊抑制率略低于母株,差异不明显（P〉0．05）。结果表明,本研究成功选育出堆形艾关耳球虫早熟株,对母株攻击具有保护力,为鸡球虫疫苗的研制奠定了基础。     

堆型艾美耳球虫pcDNA3-3-1E重组表达质粒的免疫保护性

将堆型艾美耳球虫保定株裂殖子3-1E基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组表达质粒pcDNA-3-1E,用碱裂解法大量提取重组表达质粒,纯化后免疫接种1周龄雏鸡。分别设高（100μg）、中（50μg）、低（25μg）3个剂量组,同时设活卵囊接种组、非免疫感染组和健康对照组。在7日龄时首免,14日龄加强免疫,1周后用2.5×105个E.acervulina保定株球虫孢子化卵囊进行攻毒试验。结果显示50μg的剂量可使试验鸡产生较强的抗球虫效果,攻虫鸡的卵囊产量下降67.67%,肠道病变记分降低66.96%,并使鸡的相对增重率达88.36%,ACI值为176.06。     

堆型艾美耳球虫早熟株与强毒株致病性和繁殖力的比较

为了比较堆型艾美耳球虫（E．acervulina）早熟株与强毒株的致病性和繁殖力情况,通过测定接种 E．acervulina 早熟株与强毒株后鸡只的精神状态、临床症状、增重、病变记分和卵囊产量,表明早熟株的排卵囊高峰出现在第5天,比强毒株提前1 d,早熟株的繁殖力是强毒株的85．8％;早熟株感染后对鸡只增重的影响较小,接种剂量在2．40×104个卵囊／羽之内时,相对增重率均大于90．0％,早熟株组鸡的肠道病变记分显著低于同剂量的强毒株组的肠道病变记分（P ＜0．05）。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的低致病性特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制备。     

巨型艾美球虫重组蛋白Gam82-Y和重组质粒pcDNA-gam82的免疫保护效果研究

为研究巨型艾美球虫NT株重组蛋白Gam82-Y和重组质粒pcDNA-gam82对鸡的免疫保护效果,本研究以平均增重、相对增重率及卵囊减少率等作为评价指标,检测结果显示:中剂量重组蛋白佐剂组(0.5 mg-FCA)和中剂量重组蛋白组(0.5 mg)的免疫保护力均低于卵囊免疫组(p＜0.05),但比其他各免疫组高(p＜0.05);重组质粒(pcDNA-gam82)免疫组的平均增重、相对增重率、卵囊减少率等方面与重组蛋白免疫组相同,两者均优于未免疫攻虫组(p＜0.05),但仍未能够达到卵囊免疫组的免疫保护水平(p＜0.05).     

L-NMMA对鸡球虫早熟弱毒疫苗免疫鸡增重的影响

为了研究鸡球虫早熟弱毒疫苗对免疫鸡增重的影响及一氧化氮合成酶抑制剂(L-NMMA)对免疫鸡增重和免疫效果的影响。取40只SPF雏鸡,分为空白对照组(C1、C2)和单剂量重复接种组(T1、T2),T1、T2组按推荐免疫剂量单剂量重复接种鸡球虫早熟弱毒疫苗,C1和T1、C2和T2分别于二次接种后第7、14天逐只空腹称重,剖检记录十二指肠、空肠和盲肠病变记分,取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠和盲肠进行病理组织学检查。另选取40只SPF雏鸡,分为空白对照组C20、攻毒对照组T21、免疫对照组T22和免疫加药组T23,T22和T23按推荐免疫剂量两次免疫鸡球虫早熟弱毒疫苗,T23在免疫的同时腹腔注射L-NMMA,二免后第14天T21、T22和T23均接种鸡球虫混合强毒,测定SPF雏鸡平均增重、相对增重、肠道(十二指肠、空肠和盲肠)病变记分、病变记分减少率(RLS)、血便记分、死亡率及卵囊产量等指标。结果显示,接种组的平均增重显著低于未接种组(P<0.05),接种组的十二指肠、空肠和盲肠有轻微病变且黏膜上皮细胞均有不同程度损伤和脱落;免疫加L-NMMA组一免、二免后及攻毒后试验鸡的平均增重均极显著高于免疫攻毒对照组(P<0.01),且与空白对照组鸡的平均增重无显著差异(P>0.05),且免疫对照组和免疫加药组肠道病变记分和卵囊产量无显著差异(P>0.05)。说明鸡球虫早熟弱毒疫苗对雏鸡肠道有轻微损伤,且对鸡增重有一定影响;L-NMMA可降低鸡球虫早熟弱毒疫苗对试验鸡增重的影响,且不影响疫苗的免疫效果。     

鸡胚接种柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫活卵囊的免疫保护试验

给18日龄鸡胚接种一定剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella)和/或堆形艾美耳球虫(E.acervulina)孢子化卵囊,出雏后在无球虫环境中笼养,1~10日龄每天收集各组粪便样本,计数克粪便卵囊数(OPG),并于14日龄时以大剂量同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、饲料转化率(FCR)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果显示,以E.tenella或E.acervulina卵囊免疫18日龄鸡胚,其卵囊排出的潜隐期及达到峰值的时间与1日龄雏鸡接种组相一致,有相似的排卵囊曲线,提示其诱导免疫的建立是在出雏后开始建立的。攻虫后各免疫组的RWG由攻虫对照组的31.9%~51.7%提高到了76.5%~83.6%,RCR由攻虫对照组的4.11~4.89改善为2.72~2.96,ROP降至4.7%~23.5%。结果表明以一定剂量E.tenella和E.acervulina卵囊单独或混合经羊膜腔免疫18日龄鸡胚都可以建立起针对出雏后14日龄同源攻虫的良好免疫保护力。比较混合免疫E.tenella和E.acervulina卵囊组与单一接种E.tenella或E.acervulina卵囊组的免疫效果发现,混合免疫组的各项指标均稍优于后者。     

毒害艾美耳球虫-田间分离株的致病性试验

毒害艾美耳球虫扬州田间分离株以不同的剂量(10 000,30 000,50 000,70 000,90 000个卵囊/羽)感染28日龄黄羽肉雏鸡,以平均增重、死亡率、病变记分等指标评价其致病性。结果显示,除10 000个卵囊组外,其余4个剂量组均显著影响增重(P<0.05),并引起鸡的死亡,死亡率分别为37.5%～50%、37.5%～50%、62.5%、75%～87.5%;各感染组均出现肠道病变,其中10 000个卵囊组的病变值显著小于其余4个剂量组(P<0.05),但与不感染对照组相比有显著差异(P<0.05)。结论表明,该毒害艾美耳球虫田间分离株有很强的致病性。     

柔嫩艾美耳球虫AMA1基因DNA疫苗的免疫保护效果

本研究旨在评价表达柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1(Apical membrane antigen 1,Et AMA1)基因的DNA疫苗对雏鸡柔嫩艾美耳球虫人工感染的免疫保护效果。将Et AMA1基因和鸡IFN-γ基因插入真核表达载体p CAGGS中,分别构建了真核表达重组质粒p CAGGS-Et AMA1和p CAGGS-Et AMA1-IFN-γ。将重组质粒p CAGGS-Et AMA1转染进293T细胞中,经间接免疫荧光和Western blot实验鉴定,观察其在体外表达情况。将p CAGGS-Et AMA1和p CAGGS-Et AMA1-IFN-γ于7日龄和14日龄腿部肌肉注射免疫雏鸡,21日龄人工感染1×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,第29日龄时处死试验鸡,以平均增重、卵囊产量和病变记分来评价重组质粒的免疫保护效果。结果显示,p CAGGS-Et AMA1转染的293T细胞出现明显的红色荧光;两种真核表达重组质粒免疫组鸡的平均增重与未攻虫组的平均增重差异不显著,不具有统计学意义,而未免疫攻虫组则与未攻虫组在增重方面差异具有显著统计学意义;免疫组鸡相较于未免疫攻虫组在病变记分方面显著下降;免疫组的卵囊减少率分别为67.43%和72.89%;p CAGGSEt AMA1-IFN-γ组在增重、盲肠病变记分和卵囊减少率方面都优于p CAGGS-Et AMA1组,但差异不具有统计学意义。表明构建的2种重组质粒对雏鸡柔嫩艾美耳球虫感染有一定的免疫保护效果。     

柔嫩艾美耳球虫YL株的生物学特性

用1×103个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)杨凌株(YL)孢子化卵囊感染7日龄雏鸡,对其潜隐期、最早孢子化时间、卵囊形态及大小、孢子囊大小等生物学特性进行测定。另外,对9、11及13日龄的鸡分别经口感染1×103个E.tenella YL株孢子化卵囊,对肠道病变记分、平均增重、死亡率、血便排放情况等几项指标进行测定,研究同一剂量E.tenellaYL株孢子化卵囊对不同日龄鸡的致病性。结果表明,11日龄的鸡感染后相对增重减少17.7%,病变记分平均达3.0分,9日龄组和13日龄组相对增重分别降低12.0%和17.3%,病变记分分别为2.5分和2.6分。同时测得E.tenella YL株的潜隐期为110h,最短孢子化时间为17h,卵囊大小为22.3~27.7μm×17.1~23.0μm,孢子囊大小为9.9~13.6μm×6.2~7.4μm。     

陕西省杨凌区柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及致病性研究

采用球虫早熟系虫株选育的方法,反复收集感染后最先排出的卵囊,选育出杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株并对早熟株的潜伏期、致病性及繁殖能力进行了研究。结果表明,经18代选育的鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌早熟株的潜伏期比母株缩短了24h;早熟株卵囊的形态与母株相似,但没有母株卵囊的大;早熟株的繁殖能力低于母株,每羽鸡所排卵囊总量与剂量呈正相关,而每个卵囊的繁殖能力与剂量呈负相关;早熟株的致病性低于母株。     

柔嫩艾美球虫不同剂量感染对鸡的影响及抗攻击试验研究

挑选120羽体况相近的15日龄罗斯(Ross)公鸡,均分为5组,用柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)实验室保种天山株,分50、500、5000、50000个孢子化卵囊进行感染,另设不感染球虫组。观察用不同剂量感染,对鸡生长的影响程度;并于感染后96小时起,收集各组每天排出的粪便,进行虫卵计数;感染后13天,各组称重,并抽取6羽剖杀,进行盲肠病变记分。剩余鸡进行抗攻击试验,每羽攻击10万个孢子化卵囊,攻击后8天剖杀,结束试验。结果为:①感染50、500个卵囊的组,鸡平均增重与不感染组无差异;感染5000、50000个卵囊的组,增重则明显低于不感染组(P<0.05);各组盲肠病变和血便记分随感染量增加而增高。②各组在感染后5天之内的粪便中均未检出卵囊;感染50、500个卵囊组,在感染后6～7天的粪便中查出卵囊;感染5000、50000个卵囊组,则在5～6天的粪便中发现卵囊;50000个卵囊组,排卵高峰集中在感染后6～7天(占排出总量的62.23％),而另三个组的排卵高峰不集中;所有感染组在第13天的粪便中,卵囊量已降到很低(仅占总量的0.07～7.37％)。③各组的抗攻击能力随感染剂量增加而提高;各感染攻击组的平均增重均与不感染攻击组差异达极显著(P<0.01),感染5000个卵囊攻击组的增重最好;各组的盲肠卵囊计数、血便记分、盲肠病变记分均随原感染量的增加而降低。     

陕西省杨凌区柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及致病性研究

采用球虫早熟系虫株选育的方法,反复收集感染后最先排出的卵囊,选育出杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株并对早熟株的潜伏期、致病性及繁殖能力进行了研究。结果表明,经18代选育的鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌早熟株的潜伏期比母株缩短了24h;早熟株卵囊的形态与母株相似,但没有母株卵囊的大;早熟株的繁殖能力低于母株,每羽鸡所排卵囊总量与剂量呈正相关,而每个卵囊的繁殖能力与剂量呈负相关;早熟株的致病性低于母株。