抗独特型抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫作用

用PRRSV感染SPF猪，血清检测结果显示，机体不仅产生抗PRRSV抗原的各种抗体(Ab1)，而且产生针对这些抗体的抗独特型抗体(Ab2)。根据各种蛋白质的等电点不同，应用IEF技术分离纯化出PRRSV感染猪血清中的不同IgG。分别以纯化的抗PRRSV—GP5蛋白、抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫SPF猪各5头，7d后经鼻腔感染PRRSV，定期采集血样进行病毒分离或鉴定试验。抗PRRSV-GP5蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；3头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；2头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；2头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；3头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—GP5和抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫作用显著，可作为PRRSV-GP5和PRRSV—M蛋白的替代抗原产生具有中和效应的抗体，保护机体免受PRRSV的感染。     

摄食PRRSV感染的猪肉对PRRS病毒传播风险的评估

本研究的目的是确定在试验感染猪肌肉中多长时间能检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和评估猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）通过摄食经定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）鉴定为PRRS阳性的猪肉的传播风险。试验采集135头试验猪（试验组人工接种PRRSV,89头;阴性对照组46头）的血清、淋巴组织和肌肉（背最长肌）。接种后第28天~第202天,试验组中13头猪（14.6%）的肌肉样本出现qRT-PCR阳性,在其中4头猪的血清样本和3头猪的淋巴组织样本中分离到了PRRSV。另外,通过生物鉴定在该13头试验猪中6头的淋巴组织匀浆中检测到了该病毒。通过给13头3周龄的PRRSV阴性猪饲喂定量PT-PCR检测阳性的猪肉并利用定量PT-PCR检测监控该试验猪的PRRS感染情况,研究了PRRS的传播性。定量PT-PCR检测结果显示,食用PRRS阳性猪肉的试验猪没有感染PRRS。以上资料结果表明,定量PT-PCR在猪肉中检测到了非传染的PRRSV,通过食用PRRSV感染猪肉PRRSV没有极大的传播性。     

不同CSF免疫状态下猪PRRS易感性及IFN-γ分泌细胞应答

采用酶联免疫斑点检测技术（ELISpot）检测自然状态下猪外周血单核细胞（PBMC）中分泌IFN-γ的细胞数,并用带T细胞表位的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）特异性小分子多肽刺激培养的PBMC,观察IFN-γ的分泌变化。结果显示,猪瘟病毒（Classical fever virus,CSFV）抗体阳性组中感染PRRSV比率小于CSFV抗体阴性组。CSFV抗体阳性猪PBMC中IFN-γ分泌细胞数量均高于CS—FV抗体阴性组,CSFV抗体阴性且受PRRSV感染猪的PBMC对PRRSV多肽刺激不应答。结果表明,对CSFV疫苗应答好的猪对PRRSV感染有一定的抵抗,其细胞免疫处于活动状态,提示2种传染病的免疫应答机理有部分相关性。     

摄食PRRSV感染的猪肉对PRRS病毒传播风险的评估

本研究目的是确定在试验感染猪肌肉中多长时间能检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和评估猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）通过摄食经定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）鉴定为PRRS阳性的猪肉的传播风险。试验采集135头试验猪（试验组人工接种PRRSV,89头;阴性对照组46头）的血清、淋巴组织和肌肉（背最长肌）。接种后第28天～第202天,试验组中13头猪（14.6%）的肌肉样本出现qRT-PCR阳性,在其中4头猪的血清样本和3头猪的淋巴组织样本中分离到了PRRSV。另外,通过生物鉴定在该13头试验猪中6头的淋巴组织匀浆中检测到了该病毒。通过给13头3周龄的PRRSV阴性猪饲喂定量PT-PCR检测阳性的猪肉并利用定量PT-PCR检测监控该试验猪的PRRS感染情况,研究了PRRS的传播性。定量PT-PCR检测结果显示,食用PRRS阳性猪肉的试验猪没有感染PRRS。以上资料表明,定量PT-PCR在猪肉中检测到了非传染的PRRSV,通过食用PRRSV感染猪肉PRRSV没有极大的传播性。     

一例多种病毒混合感染的实验室诊断及综合防制措施

2016年3月,彭州某猪场出现疑似猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)混合感染严重疫情,猪群发病率和死亡率较高。为进一步确诊和提供科学的防控依据,采集10头繁殖障碍母猪(未曾注射PRRSV疫苗)血样,用IDEXX试剂盒进行猪瘟病毒(CSFV)、PRRSV和PRVgE抗体检测。同时采集2头流产胎儿(对应2头流产母猪)组织分别进行CSFV、PRRSV的RT-PCR检测和PRV gE的PCR检测,采集2头腹泻同时伴随神经症状的仔猪组织进行TGEV、PEDV、猪轮状病毒(RV)的RT-PCR检测和PRV gE的PCR检测。结果显示,母猪CSFV抗体阳性率达90%,对应流产胎儿未检出CSFV,表明无CSFV感染,免疫合格;PRRSV和PRV gE抗体阳性率达100%,对应流产胎儿均测出PRRSV和PRV,表明这两种病毒感染情况严重;2头仔猪PCR和RT-PCR结果提示均有PRV、PEDV和TGEV野毒感染,并根据以上检测结果提出紧急防控措施。     

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒感染状况调查

采用RT-PCR技术,对2004年1月至2005年4月期间,广西13个市104个疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪场,无菌采取231头病、死猪的组织病料(肺脏、淋巴结、脾脏)进行了病毒检测。同时,对鉴定为PRRSV阳性的组织病料和猪场进行了猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,以确定猪群中PRRSV与PCV2、CSFV和PRV混合感染情况。结果从12个市的115份组织病料中检出PRRSV,病料的平均阳性率为49.78%(115/231),猪场的平均阳性率为61.54%(64/104),不同地市有一定的差异。PRRSV与PCV2、CSFV和/或PRV二重或多重混和感染的组织病料总数为53份,猪场总数为39个,混合感染的组织病料和猪场的总阳性率分别为22.94%(53/231)和37.50%(39/104)。混合感染的组织病料占PRRSV阳性组织病料的46.09%(53/115),混合感染的猪场占PRRSV阳性猪场的60.94%(39/64)。其中以PCV2和PRRSV混合感染的组织病料和猪场数最多。由此可见,PRRSV感染在广西猪场已普遍存在,与其他病毒混合感染现象逐渐趋向复杂化。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株人工单独感染3头3周龄仔猪，并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2头3周龄仔猪，每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现，并用HerdChek IDExx试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀，PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀，对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM)．用PAM进行抹片，同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明，用所获得的3株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外，用IIF检测7头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片。其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应；对这2头猪的肺组织进行病毒分离。在盲传到第4代时Marc-145细胞上产生明显的细胞病变，进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠，且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响

将 2 0头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪分成 6组 ,分别利用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)单独或混合感染。 7d后连同对照猪 4头 ,免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCL V) ,13d后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温 ,观察临床症状 ,每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果表明 ,非猪瘟病毒感染 7d后 ,所有各组猪均从体内检测到了相应感染的病原 ,表明 3种非猪瘟病毒感染成功。在攻击猪瘟石门强毒后 2周 ,感染了非猪瘟病毒后接种 HCL V疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外 ,11头全为猪瘟病毒 (HCV)抗原检测阳性 ,且多呈强阳性 ;而单一 HCL V疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV;所有 HCL V疫苗免疫猪均存活 ,而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16 d内死亡。     

猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到PCV2BF株341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应，可检测的最低PCV2DNA含量为1．78Pg。对30份临床组织样本进行了检测，并与PCR比较，结果表明，阴性符合率为100％，阳性符合率为88．9％。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，结果表明，感染后3d，从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号，感染后21d，肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号，至感染后42d，可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明，建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。     

间接免疫荧光试验(IIF)检测PRRSV方法的应用

用PRRSV ATCC VR-2332株人工单独感染了3头3周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染了2头3周龄仔猪,同时设立了3头健康对照猪.攻毒后每日记录试验猪体温、采食、临床表现等,并用HerdChek IDEXX Kit测其血清抗体.PRRSV+PCV2联合感染猪分别在感染后1周、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1周、2周和3周剖杀.对肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片作IIF检测.IIF试验结果表明,用所获得的3株单抗均检测到了人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原.另外,用IIF检测临床疑似PRRS的7头猪的PAM抹片,其中沭阳2头猪呈现阳性反应.对这2头猪的肺组织进行病毒分离,结果在盲传到第四代时在Marc-145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实了所获得的3株单抗检测临床样品的准确性和可靠性.综合以上试验结果,证实了所获得的3株单抗均可通过IIF试验用于临床检测肺组织中的PRRSV抗原.     

PRRSV缺失变异毒株HB-2(sh)/2002在人工感染仔猪组织中的分布与定位

用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HB-2(sh)/2002滴鼻感染30日龄健康仔猪,分别于3、7、14、28、42天宰杀,用免疫组化法对呼吸道,泌尿道,生殖道和消化道的主要器官以及脑和主要淋巴器官中的病毒抗原进行了定位分析。结果表明,在各个时间段,病毒抗原阳性率最高的器官为呼吸道、消化道沿途的淋巴结,组织中的阳性细胞多数为巨噬细胞和树突细胞,从个别猪的脑、心肌、肝和呼吸道上皮的细胞检测到阳性信号,同时发现该毒株主要在巨噬细胞和呼吸道腺上皮细胞复制。     

PRRSV SC-1株在人工感染仔猪体内的分布

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染猪体内各器官组织的分布,用PRRSV SC-1株人工感染健康断奶仔猪,接毒后23 d,无菌采集试验猪器官组织,用RT-PCR检测其中病毒核酸分布情况。结果显示,心脏、脾脏、肺脏、肾脏、支气管淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、髂内淋巴结内有病毒核酸,在所有试验猪的肺脏、腹股沟淋巴结都检测到了病毒核酸。本研究结果为PRRS诊断及病毒分离鉴定提供了一定参考依据。     

一例高致病性猪蓝耳病、猪流行性腹泻混合感染的诊断

2018年11月,湖南郴州某规模化猪场发生2~3日龄仔猪呕吐、腹泻为主的疫情,发病率70%,死亡率80%,为确定引起仔猪腹泻的原因,从发病猪群中采集2头病死猪的小肠、肺脏、淋巴结等组织进行PCR检测及基因测序分析。检测结果显示猪流行性腹泻和猪蓝耳病均为阳性,猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒均为阴性。测序分析显示所检测到的猪蓝耳病病毒与JXA1毒株高度同源,为高致病性毒株,检测到的猪流行性腹泻病毒为变异毒株,隶属于GⅡ-b群。综合分析,引起此次新生仔猪大批死亡系变异猪流行性腹泻病毒混合感染高致病性猪蓝耳病所致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布的研究

应用针对 PRRSV ATCC VR- 2 332株基因组 ORF6片段的 4 6 3bp的 c DNA探针 ,对 4 5日龄 SPF仔猪分别人工感染 ATCC VR- 2 332株及北京分离株 B96 - 4后不同时间呼吸系统及繁殖系统组织中病毒核酸的分布进行了研究。结果显示 ,在感染后 30 h,即可在鼻黏膜、气管、肺脏、睾丸、附睾、精囊、前列腺、子宫、扁桃体等组织中检出阳性杂交信号 ,且一直持续到感染后 2 8天。其中扁桃体中病毒的数目远多于呼吸系统及繁殖系统组织中的数目 ,说明扁桃体可作为活体检查的目的器官之一     

寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列，用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针，经生物素标记后，成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA，能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物，而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究，也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株的致病性研究

为了解PRRSV安徽分离株的致病性,用从安徽省某发病猪场的病死仔猪组织中分离到的SCH07毒株接种40日龄健康仔猪,对其进行临床症状、病理剖检、病理组织学观察及抗体检测,结果表明：该毒株能引起仔猪高热、呼吸困难等明显临床症状和肺脏、淋巴结肿大、出血等剖检变化,病理组织学观察可见显著的间质性肺炎等病变,攻毒后第7天试验组仔猪血清中首次检测到抗体,并有一头在第15天死亡,证实安徽省已经出现临床高致病性PRRSV毒株。     

妊娠母猪免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗对仔猪免疫功能的影响

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）呈持续性感染,给养猪业造成的损失最为严重。部分规模化猪场未实施切实的猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫,呈慢性和潜伏感染,作者现场对妊娠母猪接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）减毒活疫苗（TJM-F92株）,旨在从体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫功能角度探讨妊娠母猪接种疫苗后对仔猪免疫功能的影响。选取妊娠60 d母猪随机分为A、B 2组,A组母猪接种HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）,B组母猪接种等量生理盐水,2组所产仔猪于10、20、30日龄时检测PRRSV、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV） 母源抗体,以MTT法测定外周血T、B淋巴细胞转化率、以琼脂平板法测定血清溶菌酶含量、以Griess试剂法测定NO含量。试验结果表明,妊娠母猪免疫HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）后,其所产10日龄仔猪PRRSV母源抗体水平显著高于对照组仔猪（P＜0.05）,仔猪CSFV阻断抗体极显著增高（P＜0.01）,20日龄仔猪PRV感染抗体显著下降（P＜0.05）;免疫组和对照组所产仔猪的T、B淋巴细胞转化率及NO、溶菌酶含量均无显著差异（P＞0.05）。提示,妊娠母猪免疫HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）,对所产仔猪非特异性免疫功能和T、B免疫功能均无免疫抑制作用,仔猪抗PRRSV母源抗体、抗CSFV阻断抗体均显著增高且PRV感染抗体降低。     

怀孕后期感染PRRS病毒母猪所产新生仔猪的免疫反应

将PRRS病毒BJ－4株感染怀孕后期（约90天）的抗体阴性和阳性母猪，待自然分娩后，观察新生仔猪的免疫应答。结果显示，接种PRRS病毒BJ－4的母猪没有表现出明显的临床症状，没有出现流产死产。新生仔猪浦被子前血清中PRRS病毒核酸TR－PCR检测和ELISA抗体阴性，哺乳后特异性抗体出现，5－6周母源抗体逐渐下降；20日龄猪瘟疫苗免疫后疫苗抗体维持时间短，仔猪在40日龄后进入野毒感染的危险期。RT－nested PCR检测血清中PRRS病毒核酸和易感仔猪病毒特异性抗体监测的结果提示仔猪群内可能存在水平传播。流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群发现CD3^ 细胞减少，CD4^ 细胞显著下降，CD8^ ，CD4^ CD8^ 和SLA－DR^ 表达细胞升高。以上结果表明在感染后病毒能够长期持续性存在，猪场内新生仔猪母源抗体逐渐下降后，通过水平传播受到感染，感染后免疫应答受到不利影响。     

Immunohistochemical detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using colloidal gold.

Two cytopathic agents were isolated on porcine alveolar macrophages following inoculation with homogenates of lung tissues from pigs showing respiratory problems. These isolates were identified as porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolates by indirect immunofluorescence using a PRRS virus (PRRSV) specific monoclonal antibody (MAb) and were designated as LHVA-92-1 and LHVA-92-2. Immunogold electron microscopy using a porcine PRRS positive serum pool and protein A-gold resulted in an intense labelling of aggregates of viral particles. Dark specific cytoplasmic staining of porcine alveolar macrophages infected with both virus isolates could be observed by immunogold silver staining (IGSS) using the specific MAb. This method proved effective in detecting PRRSV antigens in several ethanol-fixed tissues of piglets intranasally inoculated with the supernatants of macrophages infected with each isolate. Immunogold silver staining was also successfully used for the detection of PRRSV antigens on sections of formalin-fixed paraffin-embedded lung tissues and on frozen sections of lungs. The present results indicate that colloidal gold may be useful for the identification and immunohistochemical detection of PRRSV in tissues.