猪细小病毒自然弱毒N株的免疫原性研究

用PPV-N株接种抗体阴性后备母猪,5天产生HI抗体,7天达到保护性水平(＞1∶256),14天达高峰.用该毒株对4月龄猪、后备母猪和怀孕母猪进行免疫原性试验,结果攻毒后5、7、9天未检测到病毒血症和未分离到病毒.攻毒后第40天剖杀2头怀孕母猪,见胎儿正常,胎儿心血HI抗体阴性,从胎儿脏器未分离出病毒.自然分娩的母猪,产仔正常,仔猪吃初乳前HI抗体阴性,而对照猪攻毒后产生病毒血症,并产下不同组合异常仔,从死胎儿脏器分离到病毒,活仔HI抗体阳性.试验还表明豚鼠对PPV-N株的抗体应答和猪的相似,可作为PPV弱毒株免疫抗体应答检测的实验动物.本研究结果证明,PPV自然弱毒N株具有良好的免疫原性.     

猪细小病毒N株的生物学和免疫学特性研究

猪细小病毒N株是从广西初产母猪所产死胎脏器分离的自然弱毒株。用这个毒株接种PPV HI抗体阴性的四月龄小猪和怀孕14～23天的后备母猪进行安全性试验,结果无任何异常临床症状、病毒血症和同居感染,母猪分娩正常,初生仔猪在吃初乳前HI抗体阴性。该毒株免疫的小猪、后备母猪和怀孕母猪,完全能抵抗猪细小病毒强毒攻击,攻毒后49天剖杀母猪,结果胎儿正常,胎儿心血HI抗体阴性,取胎儿脏器未分离出病毒,分娩母猪产仔正常,仔猪吃初乳前HI抗体阴性。而对照猪攻毒后产生病毒血症,产下不同组合异常仔,并从死胎儿脏器分离出病毒,健活仔猪吃初乳前能测出HI抗体。从而证明用N株作为弱毒苗能防止由猪细小病毒引起的繁殖障碍性疾病。     

猪细小病毒N株的安全性试验

用PPV-N株常规接种量的5倍和10倍接种PPV HI抗体阴性4月龄小猪、后备母猪和怀孕母猪,接种后第5,7、9天未能从血液中检测到病毒血症,鼻咽和直肠拭子未分离到病毒,无任何异常临床症状,母猪产仔正常,初生仔猪PPV HI抗体阴性,而未接种的对照猪产仔正常,没发现同居感染.以上研究证明PPV N株对4月龄小猪,后备母猪和怀孕母猪具有良好的安全性.     

猪细小病毒S—1毒株的分离和鉴定(二)

S一1毒株在猪肾原代细胞第1～10代之间共进行36次传代,培养物的平均HA价>384,第6代以后对细胞的最小感染量稳定在10~(-6)～10~(-7)之间,第5代PK细胞传代毒在-25℃～-30℃保存180天毒价保持10~(-5)不变,死产胎猪组织(S—1毒株分离猪)在用同样温度保存300天能重复分离到病毒,S—1毒株PK传代毒能适应于胎猪睾丸细胞株(ST)增殖,毒价达1O~(-7),以比利时荧光抗体柒色ST细胞培养物和用比利时PPV阳性血清对ST细胞传代毒作HI测定,进一步证实分离物的特异性。用PK细胞传代毒感染HI抗体阴性怀孕头胎母猪能产生明显的抗体反应。3头感染母猪中,1头(用口服途径攻毒)在感染后2～4天间出现排毒现象;从另一头母猪(用肌肉注射途径攻毒)的胎儿中分离到病毒,证实经胎盘感染的发生。     

猪细小病毒病弱毒疫苗免疫效力评价及临床免疫试验

为制定猪细小病毒病弱毒疫苗效力检验的标准,用3批猪细小病毒病弱毒疫苗进行接种猪与接种豚鼠的平行试验;同时进行临床免疫试验。3批疫苗接种豚鼠和猪后定期进行PPVHI抗体检测;猪于免疫后攻毒,并进行病毒分离。免疫母猪在怀孕早期进行强毒攻击,40d扑杀进行病毒分离。用3批疫苗免疫后备母猪统计产仔成绩。结果显示,豚鼠接种后21d、猪接种后7d全部产生抗体反应。免疫攻毒的猪均未从血浆和内脏中分离到病毒,而从对照猪分离到病毒;怀孕母猪强毒攻击后扑杀,胎儿病毒分离均为阴性,而对照猪胎儿病毒分离为阳性;统计数据表明免疫猪的产仔成绩比未免疫猪高,平均每窝多产活仔1.85头,少产死胎木乃伊胎0.65头。结果表明,当免疫豚鼠PPV HI≥64时,免疫猪能抵抗PPV强毒攻击,两者呈正相关;免疫母猪的攻毒试验表明免疫母猪能抵抗PPV经胎盘感染;临床免疫试验证明疫苗具有良好的免疫原性和安全性。     

猪细小病毒自然弱毒N株结构蛋白VP1基因的扩增及序列分析

设计两对引物,对广西分离的猪细小病毒自然弱毒N株(PPV-N株)结构蛋白VP1基因进行分段PCR扩增与测序,并与中国湖北、四川及加拿大、西班牙等地PPV毒株的VP1基因进行对比分析。结果表明这些毒株的VP1基因变异很小,发现存在有6个核苷酸高变位点。PPV-N株与加拿大NADL-2株的VP1基因的同源性最高,它们的核苷酸序列、推导的氨基酸序列的同源性分别为99.9%、99.6%,这为判断PPV-N株和NADL-2株均同属PPV弱毒株提供了分子生物学依据。     

猪细小病毒的猪体回归试验和回归阻断试验

1982年本所在上海郊区二个猪场的有繁殖障碍病的头胎母猪中分离到二株血凝性病毒,证实为PPV.为证实其致病性,作了本动物回归试验和回归阻断试验.一、材料与方法(一)种毒:PPV S—1和 S—2毒株。毒株的分离和鉴定前已报道.S—1毒株为制苗种毒,疫苗制造见文献.S—2毒株为回归试验的种毒.胎猪睾丸(ST)细胞:由中监所周泰冲教授赠送.(二)血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验:试验方法前已报道.(三)病毒分离方法:将血浆或胎儿内脏(肝、脾、肺、肾、小肠、肠系淋巴节)的1∶10混合乳剂接种于 ST 细胞,培养二周,培养液作 HA 试验如 HA 阳性,判为病毒分离阳性.(四)猪体回归试验:将 HI 阴性的怀孕头胎母猪,在孕龄30～40天时分别注射 S—2毒株的细胞传     

猪细小病毒体外培养适应毒株的培育及动物感染试验

从初产母猪流产胎儿的肠系膜淋巴结中分离到一株猪细小病毒(PPV),采用无污染的猪睾丸传代细胞系(ST)对该毒株传代,培育成一株细胞适应毒株,命名为PPV-HJ毒株。该毒株经ST细胞连续传50代,于第25代起毒价显著提升,第40代毒价维持稳定(107.2 TCID50/mL)。用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验(IPMA)检测表明,病毒感染的阳性细胞染成棕红色,病毒抗原主要分布在细胞核中。免疫电镜观察到PPV粒子呈球状,直径约21nm。基因克隆测序证实,该毒株的NS1基因序列与GenBank中PPV-ZJ毒株同源性最高,达98.41%。用该毒株第50代培养物(1×107.2 TCID50/mL)接种35日龄仔猪,未表现出明显的临床症状,剖检未观察到明显的病理学变化,PCR法在猪的肺脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、下颌淋巴结、小肠中检测到病毒核酸,表明该毒株对易感动物具有一定的感染性。本研究成功地培育出一株PPV体外细胞培养适应毒株,其繁殖性能稳定,为今后开展PPV与猪圆环病毒2型(PCV-2)混合感染的协同致病性研究,以及联合疫苗的研制奠定了基础。     

豚鼠对猪细小病毒弱毒苗抗体反应的研究

用不同批次、不同剂量、不同保存时间的猪细小病毒N株弱毒苗接种豚鼠，观察豚鼠对PPV N株弱毒苗的抗体反应。结果4种不同剂量和3个不同批次的PPV N株弱毒苗接种豚鼠后第14天均产生抗体反应，其PPV HI效价在1：16－1：64之间，0.1ml和1ml 剂量接种豚鼠产生的PPV HI抗体水平相近，抗体持续长达12个月以上。在4℃保存0天、12个月和－20℃保存2年、3年的PPV N株弱毒苗接种豚鼠，其PPV HI价在1：16－1：32之间，说明该苗在4℃至能保存12个月，－20℃能保存3年以上。比较了不同批次疫苗接种猪和豚鼠所产生的抗体反应，结果两者相似。用3批引起豚鼠产生抗体反应的PPV N株弱毒苗接种768头后备母猪，共产仔7136头，其中健活仔6575头，平均每窝产健活仔8．56头，产死仔仅0．73头。证明豚鼠是监测PPV弱毒苗抗体的首选实验动物。     

猪繁殖呼吸综合征病毒S3毒株的分离及其免疫特性研究

从某猪场仔猪体内分离到一株PPRSV毒株，该毒株能在Marc-145细胞上增殖产生致细胞病变，该病变能被PPRSV美洲型阳性血清所抑制，不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制，经美洲型PPRSV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察到直径55－60nm的病毒粒子，接种阴性仔猪未见临床症状异常，但抗体检测阳性。命名该分离毒为PPRSV－S3毒株。在S3弱毒株分离鉴定的基础上，进一步在猪体上对其致病性和免疫力进行研究。S3毒株接种仔猪后，仔猪不表现任何症状，也不向外排毒。4－5周龄的仔猪接种S3株后可产生坚强的免疫力，免疫后4－6个月能抵抗强毒攻击。后备母猪配种前2－3周免疫接种S3株，怀孕90－95d攻强毒，未发生流产、死胎、木乃伊胎、产弱仔等繁殖障碍现象。结果表明，S3是一株自然分离的弱毒株，且具有良好的安全性和免疫力。     

对弱毒疫苗(MLV)预防猪细小病毒引起的猪繁殖障碍病的评价

由猪细小病毒(PPV)引起的猪繁殖障碍病是以胚胎期感染、死胎和胎儿的本乃伊而母猪又缺乏症候为其特征。最近的研究表明,灭活疫苗对于预防本病无效,而弱毒疫苗较灭活苗能产生更为持久的免疫性。作者将10头小母猪分成二组,每组五头,一组用MLV疫苗,该疫苗的毒株(NADL—2)是从猪白细胞与猪胎细胞联合培养分离所得,然后猪胎肾细胞传30代以上,又在猪睾丸传代细胞连续传至54代,用免疫荧光技术检查其感染滴度。当半数病毒培养感染     

猪乙型脑炎减毒活疫苗毒株的选育研究

以乙脑弱毒SA14－14－2作为母种,采用代地鼠肾细胞和乳鼠皮下传代方法并结合蚀斑纯化技术,选育获得乙脑减毒活疫苗猪用毒株SA14－14－2VS株。该毒株经细胞传到15－18代,脑内接种12－14g小鼠不引起发病和死亡;皮下接种10－12g小鼠,从脑组织中不能分离出病毒;经3－5日龄乳鼠回传一代后,脑内毒力Log LD50仅为1.32-2.10,皮下接种小鼠无致病力。该毒株细胞18代毒,用乳猪传至第五代,从乳猪血液、脑、肝组织中分离的病毒再经细胞传二代,其滴度与原毒液相近,并仍对小鼠脑内感染不致死;8头不公猪经该毒接种后,未发生睾丸炎,睾丸组织中未回收到病毒;经静脉接种的2头怀孕30d的初产母猪,蝇接种后2d和4d血样中检出病毒,但接种21d剖杀时,胎儿均健尖,胎盘、羊水及胎儿脑组织中均未回收到病毒,该毒株能使豚鼠和猪产生较强的免疫应答,对小白鼠攻击的保护力比灭活疫苗主;纯毒及外源因子污染 结果表明,该毒株是纯将的乙脑病毒,符合兽用生物制品种毒标准。     

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病病毒构建及其免疫原性

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)均可引起母猪的繁殖障碍疾病。本试验以PRV基因工程弱毒株rPRVSMX为载体,构建了表达PPV流行毒株VP2基因的重组PRV(rPRVSMX-VP2)。Western blot和IFA试验均证明了重组病毒在细胞中成功表达了VP2蛋白。动物试验结果证明重组病毒可以诱导猪体产生特异性的PPV抗体,首免后40 d血凝抑制抗体(HI)为1∶192±73.9,虽然低于PPV商品化灭活疫苗免疫后所产生的HI抗体,但此时免疫系统被认为是激活的水平;重组病毒诱导产生的PRV抗体与载体毒株rPRVSMX诱导产生的抗体相当。由此可见该重组毒株经过优化后,可以作为二联疫苗的候选毒株防控猪伪狂犬病和细小病毒病。     

猪流行性腹泻弱毒疫苗的研究

用从广州地区流行性腹泻病猪分离并适应到Ｖｅｒｏ等传代细胞的猪流行性腹泻病毒Ｇ１强毒株，通过Ｖｅｒｏ、ＳＴ细胞株的连续传代，证明第７２代毒已被致弱。用８３代毒对吃初乳前的小猪以８￣１０ｍｌ剂量口服连续传５代，每代都从接种猪小肠取样接种细胞进行培养鉴定，并于增殖后作为次代接种材料，结果５代毒均未引起小猪发病，证实该代次毒株的安全、稳定、达到了常规弱毒疫苗株要求的标准。     

猪细小病毒灭活疫苗一次免疫的免疫力

1976年以后国外就开始了对 PPV 疫苗的研究,证实对临近配种的 HI 阴性猪,用灭活疫苗分2次注射,每次5～10毫升,能产生不同程度的抗体反应,强毒攻击后不出现猪毒血症,不发生病毒的经胎盘感染、Wrathall et al(1984)和 Edwardset al(1986)分别报告灭活疫苗2毫升剂量1次注射对 HI 阴性猪有免疫力.我们曾经报告,用灭活疫苗2次注射,每次5毫升,不论对是否有母源抗体的猪均能产生相当高的抗体反应,在强毒攻击后不发生病毒血症,注射疫苗的怀孕母猪还可以抵抗PPV 的经胎盘感染.本文报告我们研究的用 AEI 灭活疫苗,对有或无母源抗体的猪,注射剂量为2毫升或5毫升,一次免疫的免疫力试验结果.     

猪细小病毒(BJ-2株)灭活疫苗免疫效力试验

用实验室制备并经初步检验合格的猪细小病毒灭活疫苗免疫豚鼠和试验猪,测定免疫豚鼠和猪的HI抗体效价,并对免疫的怀孕母猪进行攻毒,探索HI抗体效价与攻毒免疫保护的相关性.结果显示免疫后一个月所有经免疫的豚鼠、猪的HI抗体效价均达到1∶256以上,高水平的抗体可持续一个月以上;初产母猪免疫后攻毒试验显示攻毒后免疫组不出现病毒血症,且免疫攻毒组的平均窝产仔数和产活仔数均明显高于未免疫攻毒组,且胎猪的体长、体重等指标存在显著差异,试验结果充分说明该疫苗的免疫效果是非常确实的.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒株的选育

将分离的一株DHv—Ⅰ野毒株经鸡胚传代,培育出DHV—Ⅰ的80代鸡胚致弱毒GFS99株。该弱毒株对1日龄雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代,也未出现毒力返强现象;1日龄雏鸭免疫100倍稀释的尿囊液弱毒GFS99后7天攻强毒GQY07株,保护率高达100％,且7日龄时即可产生高峰期中和抗体,后抗体效价有所下降,但易感期的3周内抗体保持较高水平;另外该弱毒的外源病原检验结果均为阴性和特异性实验结果良好。综上述结果表明,该弱毒GFS99株无外源病毒污染、特异性强、安全性好、遗传性稳定、免疫原性强,可以作为制备DHV—Ⅰ弱毒疫苗的候选株。     

猪细小病毒N株弱毒苗田间试验

猪细小病毒感染普遍流行于世界各地猪群,为了有效防制该病,我们研制出能预防该病感染的猪细小病毒N株弱毒疫苗(PPV-N株)[1].该弱毒苗具有良好的免疫原性和安全性[2].我们按要求制备三批PPV-N株弱毒疫苗对三个规模化猪场的后备母猪进行田间试验,现将结果报告如下.     

猪伪狂犬病-猪细小病毒病二联苗的安全性与免疫力试验

PRV-gE--PPV弱毒疫苗接种后备母猪和怀孕母猪,临床上未见不良反应,并且怀孕母猪在预产期内顺利产下健康仔猪,表明PRV-gE--PPV弱毒疫苗具有良好的安全性.PRV-gE--PPV弱毒疫苗免疫后备母猪,2周后,PPV抗体100%(8/8)转为阳性,PRV抗体85.7%(7/8)转为阳性,能产生良好的抗体反应.在免疫接种后2个月、4.5个月进行强毒攻击,免疫猪未见不良反应,对照猪未见或出现轻微的不良反应.从免疫猪的鼻、肛分泌物和血浆中未分离到PPV,而从对照猪的鼻、肛分泌物和血浆中分离到PPV和PRV.表明PRV-gE--PPV弱毒疫苗能抵抗PPV、PRV的攻击,具有良好的免疫保护力.     

猪细小病毒N株弱毒疫苗免疫产生期最小免疫量和安全性测定

猪细小病毒N株弱毒疫苗（PPVN株）是广西兽医研究所蒋玉雯等从广西初产母猪所产死胎脏器中分离出的一株PPV自然弱毒株，经生物学与免疫学特性研究证明该弱毒株具有良好的免疫原性和安全性，可作为弱毒疫苗用于预防猪细小病毒感染的发生。本研究对该弱毒疫苗进行了最小免疫量、免疫产生期和安全性测定，现将结果报告为下：