鸡病毒性关节炎弱毒疫苗的研制Ⅰ．弱毒株的筛选及其对雏鸡的安全性

将鸡病毒性关节炎病毒（ＡＶＡＶ）鸡胚毒Ｊ─１株适应于鸡胚细胞和Ｖｅｒｏ细胞，经连续传代，通过４０．５℃、３７℃、３２℃的交替升降培养温度培养，筛选出１株毒力较弱的克隆株，该克隆株蚀斑大小为２．７～３．１ｍｍ。以１０５．７２５ＴＣＩＤ５０注射于１日龄敏感雏鸡的足掌皮下和以１０４．７２５～１０６．７２５ＴＣＩＤ５０注射于１日龄敏感雏鸡胸部肌肉内，对雏鸡无致病性。该克隆株在敏感雏鸡内连传３代，无毒力返强现象。这一结果表明，本试验筛选出的ＡＶＡＶ弱毒株对雏鸡具有良好的安全性和遗传稳定性。     

鸡传染性法氏囊病病毒适应于Vero细胞的初步研究

将国内６个省市（广东、巾东、河北、辽宁、、新疆和北京）的７株鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的法氏囊组织处理后，直接在Ｖｅｒｏ细胞上盲传３～４代，均能不同程度的产生特征性细胞病变效应（ＣＰＥ），并通过选用具有广谱性的抗法氏囊病病毒的单克隆抗体（ＩＢＩ）Ｖ－ＭｃＡｂ）采用间接免疫荧光（ＩＦＡ）和碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶桥联酶显色技术（ＡＰＡＡＰ）的方法对７株分离毒的Ｖｅｒｏ第８代细胞进行鉴定，又用逆转—聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对７株分离毒的第１４代Ｖｅｒｏ细胞毒进行进一步证实，结果表明这７株ＩＢＤ囊毒均适应于Ｖｅｒｏ细胞上，这是国内首次报道将组织毒直接适应于Ｖｅｒｏ传代细胞上。     

对新城疫CS2株与4株疫苗毒株有关性能的比较

对鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）中等毒力毒株ＣＳ２株、ＮＤⅠ系、Ｒｏｋｉｎ、Ｋｏｍｅｒｏｖ和低毒力ＬａＳｏｔａ株病毒的脑内致病指数（ＩＣＰＩ）、鸡胚的半数感染量（ＥＩＤ５０）等指标进行了测定,结果是ＩＣＰＩ分别为１．２７～１．５２、１．６６～１．７０、１．４６、１．４３和０．２９～０．５;ＥＩＤ５０分别为１０＾７．５、１０＾７．５≥１０＾８．５、１０＾＾７．９和≥１０＾８．５／０．１ｍｌ。用１０倍剂量的ＣＳ２株病毒注射１月龄和１．５月龄ＳＰＥ雏鸡,均安全无不良反应,测定ＣＳ２株病毒保存期,结果在－２０℃保存６年的鸡胚２代（Ｅ２）、鸡胚６代（Ｅ６）、鸡胚１０代（Ｅ１０）毒的ＥＩＤ５０均≥１０＾７．５／０．１ｍｌ。ＮＤＣＳ２株病毒的各项指标均在中等毒力范围内,对鸡胚的半数感染量仍保持原毒（Ⅰ系）的特性,ＩＣＰＩ比原毒有所下     

猪流行性腹泻弱毒株的培育

用ＰＥＤＶＣＶ７７７株强毒适应Ｖｅｒｏ细胞系并传至１４７代。以ＰＥＤＶ沪株做效检用强毒，传代毒８３代之后适应仔猪肾原代细胞，自９０年代起进行了５次克隆纯化，克隆是２次群斑（由５～７个单斑组成）的基础上，再进行３次单斑挑选（均是１ｍｍ以内小空斑）以８３－７斑５株继续传代并做系列试验，传代毒的毒价为１０＾７．０～１０＾７．５ＴＣＩＤ５０／０．３ｍｌ。免疫接种途径为后海穴位，克隆后５代（总代次１０４代）     

狂犬病 犬肠炎 犬瘟热 犬腺病毒病犬副流感五联弱毒冻干疫苗的研究

从国外引进的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）、犬细小病毒（ＣＰＶ）、犬腺病毒－２型（ＣＡＶ２）和犬副流感病毒病毒（ＣＰＩＶ）四联弱毒样品中，分离筛选出增殖性良好的ＣＰＶ０ＸＮ１，ＣＡＶ２－ＸＮ３和ＣＰＩＶ－ＸＮ４株。另外还通过离体异种细胞交叉传代，获得的ＣＤＶ－ＸＮ１１１２弱毒株；从狂犬病毒株疫苗样品中筛选出ＥＲＡ８３６株。经试验证明这５株病毒在５代以内可作为制苗用种毒。采用静置和旋转培养法高滴度扩增这５株弱     

猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭…

采用在病毒培养液中加５－１０μｇ／ｍｌ胰酶的培养方法，将猪流行性腹泻毒ＣＶ７７７适应于Ｖｅｒｏ细胞，并传４５代，细胞病毒规律，经免疫荧光检查阳性，电镜观察可见典型冠状病毒粒子，猪传染性胃肠炎免疫荧光检查阴性，猪流行性腹泻血清可抑制细胞病变。ＰＥＤＶ ＣＶ７７７毒株１１，２５，２８，４０及４４例传代毒的毒价分别为１０＾３．５，１０＾５．５，１０＾７．０和１０＾７．０ＴＣ１Ｄ５０／０．３ｍｌ。以１１，     

鸡病毒性关节炎弱毒疫苗的研制

将鸡病毒性关节炎病毒鸡胚毒Ｊ－１株适应于鸡胚细胞和Ｖｅｒｏ细胞，经连续传代，通过４０．５℃、３７℃的交替升降培养温度培养，筛选出１株毒力较弱的克隆株，该克隆株蚀斑大小为２．７－３．１ｍｍ，以１０＾５．７２５ＴＣＩＤ５０注射于１日龄敏感雏鸡的足掌皮下和以１０４．７２５－１０＾６．７２５ＴＣＩＤ５０注射于１日龄 敏感雏鸡胸部肌肉内，对雏鸡无致病性，该克隆株在敏感雏鸡内连传３代，无毒力返强现象。这一结果     

用单克隆抗体检测禽脑脊髓炎病毒抗原

建立了抗禽脊髓炎病毒（ＡＥＶ）的单克隆抗体（ＭＡｂ）ＶＲ９－１。接种ＡＥ鸡胚适应毒Ｖａｎ Ｒｏｃｋｃｌ株、２种疫苗株和２种野毒株的雏鸡脑冰冻切片、鸡胚成纤维细胞和鸡胚脑细胞，用间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色检查，结果，均可与ＭＡｂ ＶＲ９－１起反应。该ＭＡｂ也可用于石蜡包埋切片的抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶染色。试验结果表明，该ＭＡｂ可认别ＡＥＶ毒株的一个共同抗原决定簇，可用于ＡＥＶ检测和定     

猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验

采用在病毒培养液中加５～１０μｇ／ｍｌ胰酶的培养方法，将猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）ＣＶ＿（７７７）适应于Ｖｅｒｏ细胞，并传４５代．细胞病变规律．经免疫荧光检查阳性，电镜观察可见典型冠状病毒粒子，猪传染性胃肠炎（ＴＧＥ）免疾荧光检查阴性，猪流行性腹泻（ＰＥＤ）血清可抑制细胞病变（ＣＰＥ）．ＰＥＤＶＣＶ＿（７７７）毒株１１、２５、２８、４０及４４代传代毒的毒价分别为１０￣（３．５）、１０￣（５．５）、１０￣（６．５）、１０￣（７．０）和１０￣（７．０）ＴＣＩＤ＿（５０）／０．３ｍｌ。以１１、２１及２２代的毒１０ｍｌ头口服接种未吃初乳仔猪，可使之典型发病，免疫荧光及电镜观察均呈阳性．分别以２５、２８及３１代毒０．５ｍｌ／头、１ｍｌ／头、２ｍｌ／头口服接种３日龄仔猪１８头．除０．５ｍｌ组有１头反应外，均未发病，攻毒试验的总保护率为８７．５％，对照组１００％发病．以２８代毒制备氢氧化铝灭活苗，后海穴位接种，主动免疫组８５．１９％保护，被动免疫组８５％保护，对照组１００％及９２．３％发病．     

猪流行性腹泻弱毒株的培育

用ＰＥＤＶＣＶ７７７株强毒适应Ｖｅｒｏ细胞系并传至１４７代。以ＰＥＤＶ沪株做效检用强毒。传代毒８３代之后适应了仔猪肾原代细胞。自９０代起进行了５次克隆纯化,克隆是在２次群斑（由５～７个单斑组成）的基础上,再进行３次单斑挑选（均是１ｍｍ以内小空斑）。以８３７斑５株继续传代并做系列试验。传代毒的毒价为１０７．０～１０７．５ＴＣＩＤ５０／０３ｍｌ。免疫接种途径为后海穴位。克隆后５代（总代次１０４代）～２５代的５批次主动免疫试验的总保护率为９５９２％（４７／４９）,对照组８８８％（１６／１８）发病。克隆后１７代～４０代的８批次被动免疫试验的总保护率为９６２％（７６／７９）,对照组１００％（１０／１０）发病。以克隆后２５代（总代次１２５代）进行稳定性试验,经６代次返祖传代毒力未返强,仍是稳定的,已符合弱毒株的标准。在与ＴＧＥ弱毒株组合制备的二联弱毒苗的初步田间试验中取得良好效果。     

应用反转录多聚酶链反应（RT－PCR）对鸡传染性法氏囊病毒的基因检测研究

参考Ｃｕｌ株核酸序列自行设计一对２０ｂｐ序列为引物，经反转录和ＰＣＲ扩增传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）核酸高度保守的Ｖｐ４编码区中１５０ｂｐ的片段，用于检测ＩＢＤＶ。对德国Ｃｕｌ株、美国标准强毒ＳＴＣ和变异株１０８４Ｅ、中国ｑ８０１以及７个国内野外分离株分别进行扩增，同时对新城疫病毒（ＮＤＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、禽呼肠孤病毒（ＲＥＯＶ）、禽腺病毒（ＨＡＡ）、Ｖｅｒｏ细胞、ＳＰＦ鸡法氏囊组织进行扩增后，２％琼脂糖凝胶电泳分析，１１株ＩＢＤＶ都出现分子量大小与设计相符合的ＤＮＡ扩增带，４种其他病毒、囊组织和Ｖｅｒｏ细胞都未出现任何扩增带。建立了直接采用细胞毒或组织毒进行ＰＣＲ的快速简便的核酸提取方法，应用二级ＰＣＲ扩增出了与一级ＰＣＲ相符的更加清晰的扩增带。     

鸡病毒性关节炎病毒适应Vero细胞的研究

５株已适应鸡胚细胞的ＡＶＡＶ在Ｖｅｒｏ细胞上传２－５代后；备     

具有中和活性的减蛋综合征病毒单抗的研制

用减蛋综合征病毒毒株ＷＰＤＶ２０５纯化抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，在最后一次免疫后第３天取脾细胞与ＳＰ２／０细胞在ＰＥＧ－４０００的作用下融合。用间接ＥＬＩＳＡ初步筛选出阳性克隆１０株（４Ｂ１、１Ｄ４、２Ｄ６、３Ｄ６、３Ａ５、２Ａ１、３Ｃ６、３Ｃ１、１Ｂ３和２Ｃ５）。这些杂交瘤细胞经克隆化和再次检测后生产腹水，用微量细胞中和试验筛选出具有中和活性的单克抗隆体４株（４Ｂ１、３Ｃ１、３Ｃ６和２Ｃ５），其     

从疑似IBD病鸡的法氏囊组织中分离到1株ARV

从暴发类似传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的江苏省某鸡场采集病鸡法氏囊组织制成组织悬液，接种鸡胚卵黄囊，部分鸡胚３～５ｄ死亡，部分鸡胚不死亡但有病变。用感染胚卵黄囊和绒尿膜混合物，接种鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），盲传３代后，发现以合胞体为特征的细胞病变（ＣＰＥ）。感染细胞做超薄切片电镜观察，可见细胞浆内病毒粒子呈整齐的晶格状排列。用免疫沉淀法提取病毒抽提核酸，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，可见规律排列的１０条带，呈３－３－１－３排列。与禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）参考毒株Ｓ１１３３株的核酸谱带的数目和位置相同。血清学试验与ＡＲＶ呈阳性反应，与传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）呈阴性反应。证明分离病毒为ＡＲＶ     

新城疫V4株弱毒变种的选育

应用有限稀释法通过ＳＰＦ鸡胚传代，从新城疫Ｖ２弱毒中克隆出一个变各，即２０代以后的继代毒，命名为新城疫Ｖ４克隆２０弱毒株，（ＮＤ－Ｖ４Ｃ２０）。毒以１０＾－１－１０＾１３×０．１ｍｌ接种１０日龄ＳＰＦ鸡胚尿囊腔１５０小时内，鸡胚极少死亡。每个滴度５个胚有尿液均可凝集鸡红血球。第１０代和第２０代的每个滴度５个胚有的混合尿液以１０＾－６×０．５ｍｌ一次饮水免疫鸡，即能引起ＨＩ抗体反应，也能抵抗新城疫强     

犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定

从病死犬肺,肝和淋巴结分离到２株ＣＤＶ,ＣＤＶ９３０３９和ＣＤＶ９３０４１。消除小牛血清中的干扰因素和３３℃培养是分离成功的主要因素,两株病毒均在Ｖｅｒｏ细胞生长良好,传２～４代毒力稳定,ＣＰＥ产生明显,ＴＣＩＤ５０为１０＾－６．５０～１０＾－６．７７,明显高于国内外野毒株和弱毒的毒力效价,人工感染犬死亡率较高,表明该分离株致病力较强,作者推测我国犬群可能存在ＣＤＶ强毒变异株。     

禽副粘病毒I型结构蛋白分析

鹅副粘病毒ＹＣ９７分离株,鸡源Ｖ９８分离株以及新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８、ＬａＳＯｔａ和Ｃ３０毒株,鸽副粘病毒ＹＺＰＮＦ２分离株经鸡胚增殖纯化后,进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳,结果显示ＹＧ９７和Ｙ９８２个毒株在５６ｋＤ处比另外４个毒株多出一个条带。用单抗２０１０株进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ转印,结果该单抗只对ＹＧ９７和Ｙ９８２个毒株的５６ｋＤ条带反应,证明这２株病毒的结构蛋白与经典的新城疫病毒有     

适应Vero细胞传染性腔上囊病毒X毒株对鸡胚的致病性试验

适应Ｖｅｒｏ细胞传染性腔上囊病毒（ＩＢＤＶ）Ｘ毒株,通过对鸡胚的致死作用、病理变化的结果表明,ＩＢＤＶ Ｘ毒株在Ｖｅｒｏ细胞上传代后,各试验代次毒株均能适应鸡胚,并引起鸡胚死亡,对鸡胚的致病性随传代次数的增加而减弱。     

免疫鸡羽毛根中火鸡疱疹病毒的分离与鉴定

用常规剂量的商用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）冻干苗经腹腔免疫１日龄非免疫鸡，于第３周采集羽毛根，分别采取直接法和间接法（即经过滤获取脱细胞的游离物）接种次代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），以进行病毒的分离。结果显示，在免疫后第３、４、５、６周，２种方法都分离到病毒，第７周仅直接法分离到病毒，而第８周２种方法都没有分离到。根据分离到病毒的细胞病变（ＣＰＥ）特征，结合地高辛标记的Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ－１）核酸探针检测结果，表明ＨＶＴ免疫鸡羽毛根中含有可脱离细胞的、具有感染性的疫苗株ＨＶＴ粒子，且其可检出时间具有阶段性。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体中和株的建立

将纯化的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）组织毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用ＥＬＩＳＡ，病毒中和试验检测分泌抗体，获得了６株稳定分泌抗ＩＢＤＶ单隆抗体的杂交瘤细胞，命名为ＮＩＢ－１，ＮＩＢ－２，ＮＩＢ－３，ＮＩＢ－４，ＮＩＢ－５，ＮＩＢ－６；６株ＭＣＡｂ均具ＥＬＩＳＡ特性和免疫沉淀特性，亚类鉴定表明，前４株属于ＩｇＧ２ａ，后２株属于ＩｇＧ１。杂交瘤细胞冻存６个月后复苏，均