猪伪狂犬病病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒多重PCR的构建及应用

本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法.试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增.结果显示,该方法可同时扩增出PRV(497 bp),RV(1356...     

PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×10³、1.41×10²和1.41×10³拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。     

青海省部分地区PEDV、TGEV和RV感染情况调查与分析

为了解青海省部分地区猪群中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)导致猪病毒性腹泻疫病的感染情况与发生现状,本研究首次应用RT-PCR方法对2012年采集的青海省部分地区60份伴有腹泻症状的疑似猪病毒性腹泻病毒感染的临床病料进行猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的检测与分析.结果显示PEDV、RV和TGEV的阳性率分别为76.7％、51.7％和30.0％;总单独感染率为35.0％,各自单独感染率分别为25.0％、8.33％和1.67％;总混合感染率为51.67％,PEDV/RV、PEDV/ TGEV、PEDV/RV/TGEV的混合感染率分别为23.33％、8.33％和51.67％,不存在RV/TGEV混合感染型.结果表明,青海省部分地区存在这3种导致猪病毒性腹泻疫病病毒的流行,包括单独感染流行和混合感染流行;单独感染中以PEDV流行为主,混合感染中以PEDV/RV和PEDV/RV/TGEV混合感染流行为主;总混合感染率比总单独感染率高.目前青海省部分地区发生的猪病毒性腹泻以PEDV为主要病因,且PEDV/RV、PEDV/RV/TGEV混合感染现象严重,为该地区猪病毒性腹泻的诊断和防控积累了资料.     

3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测

试验建立了用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪轮状病毒(PRV)的三重RT-PCR方法,以调查猪群中腹泻病毒感染情况.通过该方法对采自广东省规模化猪场的95份临床疑似病毒性腹泻病料进行了检测,结果表明,猪流行性性腹泻病毒阳性率为33.7%,猪传染性胃肠炎病毒阳性率为4.2%,猪轮状病毒阳性率为20%;猪流行性性腹泻病毒和猪轮状病毒混合感染率为8.4%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒混合感染率为2.1%.     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断,根据PEDV的N基因和TGEV的S基因序列设计引物,并以猪β-肌动蛋白(ACTB)作为内参对照,建立了PEDV和TGEV的TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方法对PEDV、TGEV和ACTB的检测灵敏度分别为1、10和10 copies/μL;PEDV和TGEV敏感度为10^0.02 TCID₅₀和10^0.05 TCID₅₀,高于常规RT-PCR,批内和批间变异系数均小于1%。与猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、乙型脑炎病毒、塞内卡谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型均无交叉反应。采集124份临床病料样品进行检测,PEDV阳性率为42.74%,TGEV阳性率为8.87%,检测结果与该病毒单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致,证明该方法具有较高特异性和敏感性,可用于PEDV和TGEV临床病料检测。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明：优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率...     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

Investigation and Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus,Transmissible Gastroenteritis Virus and Pseudorabies Virus of Swine Diarrhea Cases in Shandong Province

To understand porcine viral diarrhea prevalence in the large-scale pig farms of Shandong province, a total of 3 035 clinical samples were detected by PCR from January, 2014 to December, 2016.Those samples were detected for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and pseudorabies virus (PRV). The results showed that the detection rate of PEDV, PRV and TGEV were 67.49%, 9.33% and 3.29%, respectively.During the past three years, the lowest detection rate of PEDV was 48.15% in the fourth quarter of 2014,and the highest was 88.57% in the fourth quarter of 2015.In 2016,the detection rate represented fluctuate declining compared with 2015.The highest positive rate of TGEV was 18.52% in the fourth quarter of 2014,and in the third quarter of 2015 was 15.38%.The lowest positive rate of TGEV was 6.67% in the first quarter of 2016 and TGEV was not detected in the other quarters. The highest detection rate of RPV was 15.68% in the second quarter of 2016,and the lowest was 2.56% in the second quarter of 2014,except the first quarter of 2014 that the PRV was 0. By detecting three kinds of viruses in 69 clinical samples collected passively, the results showed that the detection rate of PEDV,TGEV and PRV were 86.96%,5.80% and 37.68%,respectively. The total single infection rate was 69.57%,the single infection rates of PEDV,TGEV and PRV were 57.97%,1.45% and 10.14%, respectively;The total mixed infection rate was 30.43%,the mixed infection rates of PEDV/PRV,PEDV/TGEV and TGEV/PRV were 26.09%,2.90% and 1.45%, respectively;Obviously, the total single infection rate was higher than the total mixed infection rate. The results showed that the PEDV, PRV and TGEV were prevailing in Shandong province. There were PEDV/TGEV, TGEV/PRV, PEDV/PRV mixed infection, and the number of PEDV/PRV mixed infection was in the majority. However, there was no PEDV/PRV/TGEV mixed type infection. At present, PEDV was the major pathogen of porcine viral diarrhea and the test results could provide the reference to the diagnosis of porcine viral diarrhea.     

山东省猪腹泻病例中PEDV、TGEV和PRV的感染调查与分析

为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料（共3 035份）进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查

为了解2018年广西猪群重要疫病流行情况,试验采集广西各地的病死猪组织样品及病猪腹泻拭子,应用多重实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,应用多重实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪圆环病毒3型（PCV3）,应用多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）。结果显示,所检测的694份组织样品中,CSFV、PRRSV、HP-PRRSV、PRV、PCV1、PCV2、PCV3的阳性率分别为11.10%、18.88%、7.20%、5.19%、2.45%、67.00%和5.76%;2种病原混合感染率为41.21%,3种病原混合感染率为4.32%,其中PRRSV和PCV2混合感染率最高。所检测的792份肠内容物及拭子腹泻样品中,PEDV、PDCoV、TGEV、PRoV的阳性率分别为9.72%、5.81%、1.77%和6.31%;2种病原混合感染率为5.30%,其中PEDV和PRoV混合感染率最高。结果表明,当前多种重要病毒性疫病仍在广西猪群发生和流行,并且多重感染普遍存在,应进一步加强监测和防控。     

应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒

根据GenBank上发表的猪流行性腹泻（PEDV）和猪传染性胃肠炎（TGEV）基因序列，针对其PEDVM（膜蛋白）基因保守区及TGEV的S基因（纤突蛋白基因）5’端保守区，各设计一对引物，可特异扩增出目的条带大小分别为467bp和1062bp。用上述两对引物对同一样品中的PEDV和TGEV可进行鉴别检测，对猪的其它病毒和细菌的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明：该双重PCR方法能检出PEDV1pg、TGEV0．1pg的模板。同时采用建立的多重RT-PCR及韩国引进的PEDV和TGEV病毒抗原快速诊断试剂盒检测结果显示：此多重RT-PCR方法特异性强，且较快速试剂盒更加敏感。应用多重RT-PCR对158份临床猪粪样的检测结果表明：我国很多猪场普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV污染更为严重，感染率达53．2％，但双重感染率较低，仅为4，4％。     

Investigation on Pathogens of Major Viral Diarrhea in Pig Farms in East China from 2017 to 2019

To investigate the epidemic situation of viral diarrhea in East China in recent years, and provide epidemiological survey data for comprehensive prevention, 549 fecal samples were collected in 2017-2019 from diarrhea pigs in 5 cities of East China and RT-PCR were used to detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), porcine rotavirus (PoRV), porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine deltacoronavirus (PDCoV) and porcine Sapelovirus (PSV), and statistical analysis of its positive rate and mixed infection was performed.The results showed that during 2017 and 2019, PEDV,PDCoV,PoRV,TGEV and PSV positive rate were 62.6% (372/594),27.9% (166/594),16.8% (100/594),13.3% (79/594), and 3.87% (23/594), respectively.In the double mixed infection, the average mixed infection rate of PEDV + PDCoV and PEDV + PoRV were the main ones, which were 22.4% (133/594) and 13.3% (79/594), respectively. Among the triple infections, the mixed infection rate of PEDV + PoRV + PDCoV was dominated by 7.58% (45/594), and there were no mixed infections of four and five pathogens. The highest positive detection rate of PEDV was during 2017 and 2019, and mixed infection with PoRV and PDCoV, which was currently the focus of prevention and control of viral diarrhea in East China. TGEV and PDCoV accounted for a large proportion of the detection rate of healthy fattening pigs and sows, indicating that recessive infections had become common and deserve attention from farmers. In addition, the detection rate of PSV was more lower than the other four diarrhea viruses. On the whole, since August 2018 that the farms strengthened biosecurity prevention and control measures, the detection rate of various pathogens and the detection rate of sites have shown a downward trend year by year.