不同猪源副猪嗜血杆菌河南分离株16S rRNA基因的遗传进化分析

为研究来自河南省不同猪源的副猪嗜血杆菌(Hps)的遗传演化关系,应用PCR方法扩增所分离的良种猪源、家养野猪源和地方土猪源等3株Hps(KF0901、JZ0801和XY0501)的16S r RNA基因,并进行序列比较分析。结果 3株Hps的16S r RNA基因全长均为822 bp,彼此间核苷酸序列同源性为99.3%~99.6%,与参考菌株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%;基于16S r RNA基因序列绘制的系统进化树显示,本研究中家养野猪源Hps和地方土猪源Hps均属于血清5型,而良种猪源血清5型Hps却与血清12型和血清14型的亲缘关系更近。表明Hps在良种猪、家养野猪和地方土猪之间彼此交叉感染或具有共同来源;并非所有血清5型Hps分离株都属同一分支。     

常州地区猪流行性腹泻流行病学调查

为分析常州地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况.本研究用RT-PCR方法对2014年3月至2015年12月从常州地区采集的104份病料进行病原学检测和流行病学调查,并对其中4株阳性材料所带病毒的部分M基因进行克隆、测序和分析.结果显示常州地区PEDV的个体阳性率为3.8％,猪场阳性率为7.7％;与经典病毒株CV777相比,4株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列都有突变,同源性分析表明省内本地区毒株的核苷酸同源性为97.8～100.0％,但与欧洲毒株的同源性较低;遗传进化分析表明常州地区PEDV流行株和参考株可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群,3株常州毒株和一些其他国内毒株、泰国毒株、韩国毒株以及美国毒株属于Ⅰ群,另外1株常州株与2株泰国株构成了Ⅲ群,而现用疫苗株CV777则属于Ⅱ群,常州地区内PEDV有一定程度的进化和变异,并且需要选择更有效的疫苗株来控制PEDV的流行.     

不同动物源脑心肌炎病毒的分离、鉴定和全基因组序列分析

为研究脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）对不同动物宿主的感染情况。本试验应用改进的＂细胞接种与RT-PCR方法相结合＂技术,成功分离到国内首株地方土猪源EMCV、首株家养野猪源EMCV、1株鼠源EMCV和3株良种猪源EMCV,并进行了全基因组序列测定和分析。结果显示,6株EMCV分离毒的基因组全长从7 724~7 735bp不等,ORF长度均为6 879bp,彼此间核苷酸同源性为99.3%~99.8%,与其他不同动物源EMCV参考毒株的同源性为79.9%~99.9%,与国内猪源、鼠源分离毒的同源性均在99.4%以上;各基因片段中,以VP1和2A变异幅度最大,VP2和3D最为保守;基于EMCV全基因组、ORF和VP1基因序列绘制的系统发育进化树显示,EMCV可分为G1、G2和G3 3个群,猪源EMCV主要分布在G1、G2群,鼠源EMCV在G1、G3群中均有分布;6株EMCV分离毒与其他国内参考毒株同属于G1群,但分布并不完全集中。结果表明,地方土猪和家养野猪可感染EMCV并引起发病,提醒在进行地方品种养殖和野生动物家养时要充分考虑人兽共患疫病传播的生态学;鼠在良种猪、家养野猪和地方土猪EMCV之间的交叉感染、传播与流行中起到重要媒介作用;不同EMCV地方流行株间存在较大的地域差异,其传播具有一定的区域限制性;EMCV在感染不同动物时可能会发生某些突变,以适应新的宿主。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株(ZJ16NB6)与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

江苏地区猪流行性腹泻流行病学调查及病原S基因序列分析

为探究江苏省内猪场猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行和遗传变异情况,采集江苏省13个地级市规模猪场和屠宰场健康猪群的鼻拭子和肛拭子样品,通过RT-PCR方法检测PEDV,并对部分阳性样品进行S基因序列扩增、测序及遗传进化分析。结果显示：259份猪鼻拭子样品中,PEDV阳性检出率为10.42%(27/259);178份猪肛拭子样品中,PEDV阳性检出率为9.55%(17/178)。选取的8株PEDV代表株的核苷酸序列同源性在99.2%～100%之间,氨基酸序列同源性在95.2%～97.1%之间,与国内流行毒株SD-M、JS2008的同源性最高,核苷酸序列同源性达到97%以上;遗传进化分析显示,8株PEDV代表株属于同一群,与经典毒株CV777、DR13亲缘关系较近。本研究初步明确了江苏地区健康猪群中猪流行性腹泻流行状况和PEDV遗传演化特点,为有效防控猪流行性腹泻提供参考。     

河南省2014-2015年猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化分析

为监测和探究河南省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行株变异情况,本试验对15株2014-2015年间河南省PEDV流行株S基因进行克隆及全序列测定,与河南省2011-2013年流行株以及国内、外代表毒株进行同源性及遗传变异分析,并对这些毒株S基因的N-糖基化位点及跨膜螺旋区域进行预测。结果表明:本试验得到的15株毒株之间S基因核苷酸同源性为97.0%~99.8%,氨基酸同源性为97.0%~99.5%;与2011-2013年河南流行株核苷酸同源性为97.1%~99.0%,氨基酸同源性为97.2%~98.8%,与其他地区流行毒株核苷酸同源性为92.2%~99.0%,氨基酸同源性为91.9%~99.0%;与经典毒株相比,S1区域N端存在15bp的插入和6bp的缺失,核苷酸同源性为91.7%~93.6%,氨基酸同源性为92.0%~93.6%。系统发育建树结果显示目前的流行毒株与经典毒株处于不同的2个群,流行毒株分处不同亚群。对N-糖基化位点及跨膜螺旋区域的预测得知2014-2015年河南省PEDV与经典株相比出现变异,与2010年暴发时相比存在部分突变,毒株之间存在部分差异,研制出有效的针对流行毒的疫苗依然是目前防控该病的重中之重。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

流行性腹泻病毒5株猪安徽流行株S基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,试验对5株PEDV安徽流行毒株S基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果显示,5株PEDV安徽流行毒株S基因的全长均为4 161 bp,编码1 386个氨基酸,核苷酸同源性为98.7%~99.8%,它们与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.6%~99.8%之间;进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株亲缘关系较近。研究结果可为PEDV的防控和疫苗研制提供参考和依据。     

河北省部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查与分析

本研究旨在初步了解河北省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和遗传变异情况,于2016-2017年从保定市及周边地区采集腹泻猪粪便样品327份,采用RT-PCR检测PEDV流行情况,同时对获得的11株PEDV的S基因部分基因(S1)进行扩增、测序和分析。结果显示:327份粪便样品中有84份检测为PEDV阳性,检出率为25.08%;获得的11株PEDV分离株S1基因序列核苷酸同源性为95.8%～100.0%,与疫苗株CV777、LZC株相比,核苷酸同源性为89.5%～90.8%;本次研究获得的11株PEDV分离株均位于G2亚群,与2010年后国内流行的PEDV分离株相距较近,但与PEDV经典毒株亲源性较远。本次研究表明,河北省流行的PEDV毒株多为变异株,生猪养殖企业(户)应注意且加强猪场生物安全。     

1株猪流行性腹泻病毒S基因的克隆及序列分析

本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。     

2015-2018年广东省猪流行性腹泻病毒M基因的遗传进化分析

本试验通过对22株采集于2015-2018年广东省内猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株的M基因进行克隆和测序,并将测序结果与NCBI中PEDV参考株M基因进行同源性分析和构建系统进化树,从而了解广东省PEDV流行株的近年来遗传变异情况。结果显示,22株PEDV流行株间核苷酸序列同源性为97.5%～100.0%,与华南地区参考株M基因核苷酸序列同源性为97.7%～99.9%,与国内较早分离株CH/S和经典毒株CV777同源性较低,分别为97.5%～98.1%、97.7%～98.2%。PEDV M基因遗传进化分析显示,22株广东PEDV流行株的同源性较高,亲缘关系紧密,此外,22株广东PEDV流行株与大部分代表性毒株、疫苗株亲缘关系较远,如国内早期分离株CH/S、经典毒株CV777、韩国株KRPEDV-9-Vaccine、泰国株M_NIAH100541_08、日本株JMe2、英国株Brl/87等。试验结果表明,广东省当前的PEDV流行毒株存在基因变异并形成独特进化分支。     

猪流行性腹泻病毒贵州流行株N基因的克隆、测序与生物信息学分析

为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明：PEDV-GZ2022株N基因大小约为1 364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%～99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、...     

广东省猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了研究广东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株ORF3和M基因的变异情况,试验于2012—2013年从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪的小肠,通过PCR扩增得到8株PEDV的ORF3和M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明:8株PEDV的ORF3基因与参考毒株核苷酸的同源性为94.7%~99.9%,其中GD-DG毒株与LZC毒株比较核苷酸的同源性最低(94.7%),GD-HY毒株与中国TX2011毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%);8株PEDV的M基因与参考毒株核苷酸的同源性为95.7%~99.9%,其中GD-MM毒株与泰国M_NIAH380_98毒株比较核苷酸的同源性最低(95.7%),GD-HZ毒株与韩国CPF299、PFF188、PFF285毒株及泰国KU01CB08毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%)。说明近年来广东省流行的PEDV毒株以变异株为主,与经典株CV777的亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株S基因遗传变异分析

为分析山西地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,试验利用RT-PCR方法对2014-2015年山西省疑似猪流行性腹泻的阳性病料进行克隆和测序,获得4个S基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行比对分析。序列分析结果显示,4株PEDV山西分离株的S基因与CV777 vaccine相比,在170~171 bp之间插入12个核苷酸,在401~402、454~455 bp之间均插入3个核苷酸,在461~468 bp之间缺失6个核苷酸。4株PEDV山西分离株S基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~99.8%和98.6%~99.7%,与2011-2015年中国流行毒株、CV777 vaccine、attenuated DR13、CV777的核苷酸同源性分别95.0%~98.5%、93.2%~93.6%、93.2%~93.7%、93.7%~94.4%,氨基酸同源性分别为96.2%~98.9%、91.9%~92.6%、92.1%~92.9%、92.9%~94.0%。遗传进化树分析结果表明,PEDV S基因分为3个群,4株PEDV山西分离株属于第一群,与2010年以后国内流行毒株（除AH-M、SQ2014）的亲缘关系较近,与2010年以前中国流行毒株、2个日本株、7个韩国株、2个疫苗株的亲缘关系较远。研究结果提示山西省流行的PEDV发生较明显的变异,需研发新的疫苗来控制PEDV的暴发。     

粤北地区新生仔猪腹泻病原学调查及PEDV ORF3基因分子特征和遗传变异分析

为了解粤北地区新生仔猪腹泻病的主要病原,本试验采用实时荧光定量RT-PCR方法对2015年粤北地区6个规模化猪场31份新生仔猪腹泻样品进行了猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)检测,并对5株PEDV流行毒株ORF3基因进行测序分析。病原检测结果显示,83.87%(26/31)样品为PEDV阳性,没有检测到TGEV和PoRV阳性样品。对PEDV ORF3基因序列分析结果显示,5个流行毒株ORF3基因全长均为675bp,相互之间核苷酸同源性为98.7%~100.0%,与参考序列同源性为94.5%~100.0%,多个核苷酸位点发生了共同突变。系统进化树分析结果表明,PEDV可分为两个基因群,粤北地区流行的PEDV与2013-2015年间在中国部分地区、东南亚、北美洲和欧洲流行的PEDV遗传关系较近,位于基因1群中的同一个亚群,而2011-2012年中国流行的PEDV主要毒株及疫苗毒株则归类于另外两个基因亚群。结果表明,粤北地区新生仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,PEDV基因随着时间推移呈现不断进化和变异趋势。     

猪流行性腹泻病毒广东分离株GD/JMEP的遗传演化分析

为了解广东地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行现状,对广东地区猪场进行了PEDV流行株的分离,分离得到1株猪流行性腹泻病毒,对分离毒株的S、N、M及ORF3基因进行遗传演化分析。结果表明:检测的PEDV毒株GD/JMEP与经典的CV777毒株亲缘关系较远,与近几年广东地区流行的PEDV毒株处于一个群,亲缘关系较近;通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失;N、M基因核苷酸和氨基酸同源性分析发现,GD/JMEP与EAS1等经典毒株的同源性相对较低,与2013—2015年中国、美国、韩国等流行毒株的同源性较高;相比于经典传统毒株CV777,GD/JMEP的N基因存在9个氨基酸的差异,M基因存在11个核苷酸位点的变异和3个氨基酸的改变S基因存在几个位点核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,M、N基因存在核苷酸位点的改变,S基因在406位点存在新的突变;通过氨基酸比对分析,GD/JMEP发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验所检测的PEDV为目前广东流行毒株。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

云南省某腹泻仔猪群猪流行性腹泻病毒核酸检测及其N基因序列分析

猪流行性腹泻是猪场新生仔猪腹泻的主要病原之一。为确定云南省曲靖市某猪场新生仔猪出现呕吐、腹泻和高死亡率的病因,采集病死仔猪肠道、肠系膜淋巴结、脾脏等组织病料,处理后提取病原核酸,通过RT-PCR进行导致仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原核酸检测。结果显示,仅PEDV核酸阳性,其他病原均为阴性。对检出的PEDV阳性样品N基因进行序列分析发现：阳性样品N基因与河北的T10-HB2018毒株核苷酸同源性最高,为99.7%;与疫苗株AJ1102和LW/L毒株核苷酸同源性为97.4%~97.5%,在同一个分支上,均属于基因II群;与经典毒株CV777株核苷酸同源性略低,为95.7%。结果表明,引起该仔猪群腹泻的主要病因为PEDV感染,流行毒株未发生变异,当前疫苗对其防控有效。依据分析结果,该场采取PEDV疫苗紧急免疫,使疫情得到有效控制。本研究对于指导该地区猪群腹泻病防控具有参考意义。     

6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。