浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆与序列分析

为研究广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的变异情况,于2012-2013年间从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪样本。通过PCR方法扩增到12个样本的PEDV的S1基因序列,并进行序列比对及遗传分析。结果 12个样本PEDV的S1基因序列之间的核苷酸同源性为91.1%~99.6%,氨基酸的同源性为88.5%~99.1%。12个样本PEDV的S1基因序列与国内参考毒株核苷酸的同源性为91.0%~99.9%,氨基酸的同源性为88.5%~99.7%。与国外参考毒株核苷酸的同源性为89.0%~99.7%,氨基酸的同源性为86.5%~99.4%。与经典毒株CV777的核苷酸同源性为91.0%~100.0%,氨基酸的同源性为88.3%~99.9%。其中,仅GD-HY的S1基因与CV777的同源性达100.0%,其他同源性较低。表明近年广东省的PEDV流行毒株以变异株为主,与疫苗株(CV777)的亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株S基因遗传变异分析

为分析山西地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,试验利用RT-PCR方法对2014-2015年山西省疑似猪流行性腹泻的阳性病料进行克隆和测序,获得4个S基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行比对分析。序列分析结果显示,4株PEDV山西分离株的S基因与CV777 vaccine相比,在170~171 bp之间插入12个核苷酸,在401~402、454~455 bp之间均插入3个核苷酸,在461~468 bp之间缺失6个核苷酸。4株PEDV山西分离株S基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~99.8%和98.6%~99.7%,与2011-2015年中国流行毒株、CV777 vaccine、attenuated DR13、CV777的核苷酸同源性分别95.0%~98.5%、93.2%~93.6%、93.2%~93.7%、93.7%~94.4%,氨基酸同源性分别为96.2%~98.9%、91.9%~92.6%、92.1%~92.9%、92.9%~94.0%。遗传进化树分析结果表明,PEDV S基因分为3个群,4株PEDV山西分离株属于第一群,与2010年以后国内流行毒株（除AH-M、SQ2014）的亲缘关系较近,与2010年以前中国流行毒株、2个日本株、7个韩国株、2个疫苗株的亲缘关系较远。研究结果提示山西省流行的PEDV发生较明显的变异,需研发新的疫苗来控制PEDV的暴发。     

2011—2012年四川省猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析

为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本试验从四川省11个市19个不同地区发生仔猪腹泻疾病的猪场采集的病料中分别扩增到8个PEDV(SC-8)ORF3和部分S基因序列,将其进行比对和遗传演化分析。结果显示,SC-8的ORF3基因包含674~676个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的国内外地方流行株的核苷酸序列同源性为95.7%~99.9%,氨基酸序列同源性为98.2%~100%,与标准毒株CV777相比,核苷酸序列和氨基酸序列除存在点突变现象外,部分序列还存在核苷酸的插入和缺失性突变;部分S基因扩增长度为981bp,编码327个氨基酸,与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为93.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为93.5%~100%,与标准毒株CV777相比,四川-绵阳(SCMY)分离株在92~93nt之间存在1个核苷酸插入,在2~29aa之间也有18个氨基酸发生了突变;系统进化树分析表明,8株PEDV ORF3基因均与野毒株亲缘关系较近,而与弱毒疫苗株亲缘关系较远;SC-8的部分S基因均与国内地方流行毒株亲缘关系较近,而与国外分离株的亲缘关系较远。     

7株猪流行性腹泻病毒M基因的克隆与分析

采用RT-PCR方法对2012-2014年收集的7份四川规模化猪场送检猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的阳性临床样品中病毒M基因进行扩增,纯化回收目的片段后连接到pMD19-T载体,经序列测定与GenBank收录的30条PEDV参考毒株的序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析、构建系统进化树。结果显示,7株PEDV四川株间核苷酸以及氨基酸同源性分别高达98.4%~99.9%和97.4%~99.1%,与参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是95.7%~99.9%和95.2%~99.6%,PEDV四川株与国内外近3年的PEDV毒株均在系统进化树上的同一分支,亲缘关系较近,而经典毒株CV777与国内早期PEDV株处于另外一个分支。表明目前流行的PEDV M基因与往年相比出现一定的变异,但是仍相对稳定。     

3株临床分离的猪流行性腹泻病毒S基因克隆及序列分析

对临床分离鉴定的3株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆及序列分析,对丰富我国PEDV的遗传衍化特征具有重要意义。S基因序列分析发现,JX18毒株与CV777亲缘关系较近,核苷酸同源性为99.71%,氨基酸同源性95.7%,属于G1-b进化分支。JX18毒株与CV777经典毒株S蛋白氨基酸序列相比较,不存在氨基酸的插入或缺失,在中和表位区及已鉴定抗原表位区仅有一处氨基酸突变。SD18、JingTai18与PEDV CV777亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为93.64%和92.64%,S蛋白氨基酸序列同源性分别为93%和93.5%。SD18和JingTai18位于G2-b进化分支。SD18与JingTai18株与CV777经典毒株相比,S蛋白氨基酸序列中存在插入缺失及多位点的氨基酸突变。研究结果为进一步了解我国PEDV流行及变异情况提供了数据支持。     

流行性腹泻病毒5株猪安徽流行株S基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,试验对5株PEDV安徽流行毒株S基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果显示,5株PEDV安徽流行毒株S基因的全长均为4 161 bp,编码1 386个氨基酸,核苷酸同源性为98.7%~99.8%,它们与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.6%~99.8%之间;进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株亲缘关系较近。研究结果可为PEDV的防控和疫苗研制提供参考和依据。     

6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。     

2012-2014年我国南方地区猪流行性腹泻病毒遗传进化分析

为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本试验对2012-2014年我国南方地区7个省市17份PEDV阳性样品的S基因主要的中和表位区(COE)序列进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并与国内外的代表性毒株进行序列比对和遗传进化分析,结果表明,本研究中的17株:PEDV毒株COE中有16株属于第1大群,而GD/FSss/2014属于第Ⅱ大群,所有COE的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.9%~99.8%和88.6%~100%,它们与经典毒株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%~99.5%和90%~98.6%,与疫苗株CV777 Vaccine的核苷酸和氨基酸同源性分别为95%~97.1%和92.9%~97.9%。COE的氨基酸序列发生了不同程度的点突变,为PEDV遗传进化分析和疫病防制提供了新的参考。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

猪流行性腹泻病毒河南株ORF3基因分子流行病学分析

为了解猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)河南株的起源和遗传变异,本试验对2014年8月—2015年5月,来自河南省16个规模猪场仔猪表现为严重腹泻、食欲下降和脱水等临床特征的22份病料样品,利用RT-PCR方法,扩增PEDVORF3基因,回收PCR产物克隆至pMD18-T载体,并进行测序分析。结果显示,22份病料样品均能扩增出PEDVORF3基因,其序列长度均为849bp,包含一个完整阅读框(675bp),编码224个氨基酸残基。22个河南株之间核苷酸同源性为95.9%~100%,与欧洲经典毒株CV777同源性介于97.1%~97.9%,存在8个位点发生相同的氨基酸置换,与Truncated CV777株同源性介于94.8%~95.4%。基因遗传进化树分析表明,PEDV毒株可分为2大群,河南株属于第Ⅱ群,整体独立成支,与河南往年流行株、国内分离株、日本、美国及韩国毒株亲缘关系较近,而与CV777株、Truncated CV777株亲缘关系较远。结果表明PEDV河南株ORF3基因存在变异,为PEDVORF3基因的蛋白功能研究和河南省PED的防控提供技术支持。     

2020-2021年新疆地区猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析

为了解新疆地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况，于2020-2021年从新疆地区规模化猪场采集到326份临床仔猪腹泻病料和肠组织，利用RT-PCR方法对PEDV进行检测，选取部分PEDV阳性样品进行S基因全序列的克隆和测序，并对其序列、遗传进化和抗原表位进行分析。结果显示，326份样品中共有152份样品为PEDV阳性，阳性率为46.6%。选取的11份阳性样品中的PEDV S基因核苷酸(氨基酸)同源性为99.0%～100%(98.2%～99.9%),与GenBank中登录的PEDV参考毒株核苷酸(氨基酸)同源性为92.6%～98.0%(91.2%～97.7%),与经典株CV777核苷酸(氨基酸)同源性为93.1%～93.4%(92.3%～92.7%)。遗传进化分析显示，11份阳性样品均位于GIIa亚群，与中国疫苗株CV777处于不同的分群，说明新疆部分地区PEDV流行株与疫苗毒株CV777亲缘关系较远。序列比对结果显示，11份阳性样品中的PEDV S蛋白均存在氨基酸的插入和缺失，中和表位的COE区域变异较大，这可能会降低常规疫苗的免疫保护作用。结果表明，从分子水平明确了2020...     

猪流行性腹泻病毒广东分离株GD/JMEP的遗传演化分析

为了解广东地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行现状,对广东地区猪场进行了PEDV流行株的分离,分离得到1株猪流行性腹泻病毒,对分离毒株的S、N、M及ORF3基因进行遗传演化分析。结果表明:检测的PEDV毒株GD/JMEP与经典的CV777毒株亲缘关系较远,与近几年广东地区流行的PEDV毒株处于一个群,亲缘关系较近;通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失;N、M基因核苷酸和氨基酸同源性分析发现,GD/JMEP与EAS1等经典毒株的同源性相对较低,与2013—2015年中国、美国、韩国等流行毒株的同源性较高;相比于经典传统毒株CV777,GD/JMEP的N基因存在9个氨基酸的差异,M基因存在11个核苷酸位点的变异和3个氨基酸的改变S基因存在几个位点核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,M、N基因存在核苷酸位点的改变,S基因在406位点存在新的突变;通过氨基酸比对分析,GD/JMEP发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验所检测的PEDV为目前广东流行毒株。     

陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒S、M和N基因的遗传变异分析

为了解陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传和变异情况,采集陕西省部分地区规模化猪场的5份疑似PEDV感染的猪小肠内容物,进行PEDV S、M和N基因的RT-PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传变异分析。结果表明,5份病料均能扩增出PEDV S、M和N基因,5株病毒分别命名为SXSL、SX-BJ、SX-YL、SX-WN和SX-HZ株。序列分析表明,5株毒株之间的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为96.7%~99.8%、98.4%~100%和97.2%~99.9%;氨基酸序列的同源性分别为97.4%~99.9%、98.2%~100%和98.2%~100%。该5株病毒与中国疫苗株CV777的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为93.9%~99.8%、98.1%~100%和95.3%~99.9%,氨基酸序列的同源性为93.6%~99.9%、96.2%~100%和98.2%~100%。遗传进化分析结果显示,5个陕西分离株的S基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远,与近年来中国株、日本株以及韩国株亲缘关系较近。SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较近,且与中国株CHGD-01亲缘关系密切。SX-WN株和SX-HZ株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远。该5株病毒的S基因以及SX-WN株和SX-HZ株的M基因和N基因变异程度较大,而SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株三个流行株均与中国株CHGD-01亲缘关系密切,并且与近年在陕西省流行的PEDV也不完全相同。     

2011年—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S(GenBank登录号:JN547228)、疫苗株CV777(GenBank登录号:AF353511)和Attenuated DR13(GenBank登录号:JQ023162)的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。     

广东省猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了研究广东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株ORF3和M基因的变异情况,试验于2012—2013年从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪的小肠,通过PCR扩增得到8株PEDV的ORF3和M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明:8株PEDV的ORF3基因与参考毒株核苷酸的同源性为94.7%~99.9%,其中GD-DG毒株与LZC毒株比较核苷酸的同源性最低(94.7%),GD-HY毒株与中国TX2011毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%);8株PEDV的M基因与参考毒株核苷酸的同源性为95.7%~99.9%,其中GD-MM毒株与泰国M_NIAH380_98毒株比较核苷酸的同源性最低(95.7%),GD-HZ毒株与韩国CPF299、PFF188、PFF285毒株及泰国KU01CB08毒株比较核苷酸的同源性最高(99.9%)。说明近年来广东省流行的PEDV毒株以变异株为主,与经典株CV777的亲缘关系较远。     

一株猪流行性腹泻病毒S、M、N基因的遗传变异分析

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株与流行毒株的遗传变异和抗原位点的差异性,以RT-PCR进行PEDV CV777疫苗株和JS2016流行株S、M、N 3个基因的克隆测序,进行PEDV S、M、N 3个基因的核酸序列同源性分析,并通过软件比对CV777与JS2016毒株在这3个基因上的抗原差异。S、M、N基因的同源性分析表明流行毒株与CV777存在变异,但同源性在93%以上;免疫原性预测结果显示2个毒株在S、M、N 3个基因上的抗原区域存在较小的差异。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

1株猪流行性腹泻病毒S基因的克隆及序列分析

本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。