可诱导表达小反刍兽疫病毒P蛋白细胞系的建立

为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白(P)的生化功能,本研究通过PCR将PPRV p全长基因扩增后克隆至真核表达载体pcDNA4/TO中,构建了重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP。将该质粒转染至已稳定转入pcDNA6/TR质粒的T-REx293细胞中,并用博来霉素和稻瘟菌素筛选存活克隆。将强力霉素添加至存活细胞克隆中诱导P蛋白表达,Western blot及间接免疫荧光试验鉴定出可诱导表达P蛋白的细胞克隆,扩增阳性克隆获得能够稳定表达P蛋白的细胞系。Western blot显示该细胞系表达的P蛋白能够与山羊PPRV阳性血清反应,并能够有效抑制聚肌胞苷酸诱导的STAT1磷酸化,表明该细胞系表达的重组PPRV P蛋白具有与野生型P蛋白类似的生物活性。本研究利用Tet on系统建立了表达PPRV P蛋白的真核细胞系,为深入研究PPRV的致病机制奠定了基础。     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础.     

流行性乙型脑炎prM蛋白剪切位点突变的prM-E蛋白表达细胞系的建立

为建立稳定共表达乙型脑炎病-毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E.将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系.经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白.该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础.     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体

为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。     

稳定表达犬瘟热病毒基质蛋白的细胞系Vero-SLAM-M的构建

为了建立稳定表达犬瘟热病毒基质蛋白(M)的细胞系,从犬瘟热病毒狐狸源分离毒株SD16F中扩增出M基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo的Xho I/Not I位点处。重组质粒经PCR、Xho I/Not I双酶切及测序鉴定后转染Vero-SLAM细胞,利用G418抗性压力筛选阳性细胞,并采用RT-PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定转染细胞中M蛋白的表达情况。结果表明,成功构建了重组质粒pCI-neo-M,瞬时及稳定转染Vero-SLAM细胞后,RT-PCR和IFA能够检测到M基因的转录和表达,且G418筛选后细胞与其亲本Vero-SLAM细胞生长特性基本一致,表明获得1株能稳定表达M蛋白的细胞系,命名为Vero-SLAM-M。     

禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。采用间接免疫荧光、western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达重组蛋白分子量约为64 ku;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具有良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具有良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为进一步研究HA基因功能活性和制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。     

稳定表达流感病毒PR8 HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定

为建立稳定表达流感病毒(IV)HA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeⅠ和NotⅠ两个限制性内切酶位点之间插入PR8株HA基因的开放阅读框,构建重组质粒pMX-PR8HA,将pMX-PR8 HA与3个分别表达VSVG、gag/pol和NF-KB的重组质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。用含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行筛选、纯化得到稳定表达PR8株HA蛋白的细胞系。连续传10代后,进行PCR、RT-PCR、IFA和western blot鉴定,结果表明,获得了能够稳定表达IV PR8株HA蛋白的MDCK细胞系。该细胞系的建立有望为IV表达外源基因提供可靠的培养细胞系。     

猪δ冠状病毒RBD蛋白在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然构象且反应原性良好的猪δ冠状病毒((PDCoV))受体结合域(RBD)蛋白,根据PDCoV流行株CC-HN2K-02株S蛋白编码序列,筛选、设计、优化并合成其RBD段DNA序列,将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBac~(TM)Dual上,获得pFBD-PDR重组质粒。将该重组质粒转化到DH10Bac~(TM)大肠杆菌感受态细胞中,进行2轮蓝白斑筛选并进行PCR鉴定获得阳性重组杆状质粒Bacmid-PDR;通过脂质体转染SF9细胞进行病毒拯救,出现明显病变后收取上清,并在正常SF9细胞中盲传3代,获得的杆状病毒命名为rBV-PDR。利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测rBV-PDR感染昆虫细胞后的蛋白表达情况。结果:重组质粒pFBD-PDR酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PDR构建成功,杆状病毒中能够表达PDR蛋白且能与Sterp-tag抗体发生特异性结合,IFA鉴定出特异性红色荧光,表明本试验成功表达了PDCoV-RBD蛋白,为深入开展PDCoV抗体的制备、新型疫苗、诊断试剂研发奠定了基础。     

稳定表达绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白A549细胞系的建立

为研究绵羊肺腺瘤病病毒(JSRV)表面蛋白(SU)的致瘤机制,本研究构建稳定表达SU的羊肺细胞A549细胞系.采用PCR方法从含su基因的pGEX-4T-1-SU重组质粒中扩增SU编码序列,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,转染A549细胞.通过G418筛选,对转染阳性细胞进行纯化,获得稳定表达JSRV SU蛋白的A549细胞系.以间接免疫荧光及western blot鉴定SU的表达状况,并运用共聚焦显微镜确认SU蛋白的亚细胞定位.结果表明,重组蛋白SU在A549细胞中有效表达,而且主要分布于细胞质中.该细胞系的建立为SU生物学功能的体外研究提供了平台.     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5，亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型，轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段，经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1～aa55，通过合成一系列重叠多肽，经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为²¹QQHSTRSTET³⁰。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示，CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带；IFA结果显示，感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明，该株MAb既能够与原核表达的CDV...     

小反刍兽疫病毒F蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组质粒F-p Fast Bac HTA,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒F-Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,获得含有PPRV F基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出59 ku左右的表达蛋白,Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测该蛋白具有很好的反应原性。通过免疫BALB/c小鼠,ELISA结果证明F蛋白可以诱导产生高水平的血清抗体;MTT试验结果显示F蛋白能刺激T淋巴细胞增殖;说明表达的F蛋白具有良好的免疫原性。以上研究结果为小反刍兽疫病毒的检测方法及亚单位疫苗的研究奠定基础。     

表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒Snyder Hill株的构建及鉴定

为构建一株表达狂犬病病毒(RV) G蛋白的重组犬瘟热病毒(CDV),本研究以本实验室分离的CDVSnyder Hill疫苗株为基础,在CDV P和M基因之间插入RV弱毒疫苗株ERA G蛋白基因,构建重组质粒p CI-CDV-RVG及表达CDV N、P和L蛋白的辅助质粒p CI-CDVN、p CI-CDVP和p CI-CDVL,将重组质粒和辅助质粒共转染BSR细胞,拯救获得了表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒(rCDV-RVG),将该重组病毒在Vero细胞中传代,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定。结果显示RV G基因能够在r CDV-RVG中稳定存在并正确表达。病毒生长动力学曲线显示,重组病毒在Vero细胞中的增殖效率与拯救的亲本病毒r CDV无显著差异(p0.05)。本研究表明CDV Snyder Hill株作为载体表达外源基因的潜力,为研制高效、安全、廉价的CDV-RV二联活载体疫苗奠定基础。     

鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭肠炎病毒(DEV)VP22蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以DEV Clone-03基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增UL49基因并克隆至pMD-18载体.重组质粒经测序鉴定后,将UL49基因亚克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a-UL49.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行western blot鉴定.结果显示,表达的重组蛋白分子量约为36 ku,与预期的大小一致.重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.将重组蛋白纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,制备MAb,经间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定.获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2810、2G1、3F10和3G2.其MAb亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM.4株MAbs都能够与DEV Clone-03发生特异性反应,表明能够识别天然构象的VP22蛋白.这4株MAb可用于DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位的研究.     

稳定表达小反刍兽疫病毒衣壳蛋白的Vero细胞系的筛选和鉴定

本研究利用PCR方法扩增小反刍兽疫病毒(PPRV)的衣壳蛋白(N蛋白)基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-pN.利用电转的方法将该重组质粒转入非洲绿猴肾(Vero)细胞,并使用抗生素G418进行筛选.Western blot试验结果表明,N基因在Vero细胞中得到了表达,且...     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP_2细胞株的建立及其对p65核转位影响的研究

为建立一株稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP_2)的细胞株,本研究通过脂质体2000介导的方法将携带有PRRSV NSP_2基因序列的真核表达载体(pcDNA3.1-5'Flag-Nsp_2)瞬时转染于HEK293细胞,应用G418筛选、间接免疫荧光(IFA)与western blot方法进行鉴定,获得了1株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,命名为NSP_2-11C1-HEK293;将TNF-α作用于该细胞株,采用IFA分析稳转细胞内NSP_2对p65入核的影响。IFA结果显示NSP_2主要在细胞浆中围绕细胞核表达,在细胞中的表达率达95%以上;western blot结果显示出现120 ku的蛋白条带,与预期相符。结果表明本研究获得了一株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,在该稳转细胞内NSP_2对p65的入核并没有影响,这为进一步研究揭示PRRSV的致病机理奠定基础。     

稳定表达马属动物SAMHD1蛋白的U937细胞系的建立及其抗病毒活性初步研究

为研究马属动物SAMHD1的抗病毒活性,本研究构建了稳定表达马SAMHD1(eqSAMHD1)、驴SAMHD1(doSAMHD1)的U937细胞系。利用pLPCX慢病毒表达载体构建重组质粒pLPCX-doSAMHD1-HA和pLPCX-eqSAMHD1-HA。将重组质粒和假病毒包装重组质粒(pCgp和pVSV-G)共转染于293T细胞中,制备表达SAMHD1的假病毒,将其感染人急性单核细胞白血病细胞系U937,利用嘌呤霉素筛选,建立了稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1的U937细胞系。经western blot鉴定,该细胞系能够稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1蛋白。将人类免疫缺陷病毒(HIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的假病毒感染该细胞系,结果显示表达eqSAMHD1和doSAMHD1的细胞系均能够显著抑制HIV假病毒复制,限制倍数分别为17~19倍和14~18倍;两种细胞系也能够抑制EIAV假病毒复制,限制倍数分别为3~4倍和2~3倍。该细胞系的建立为进一步评价和研究马属动物SAMHD1的抗病毒机制奠定了基础。     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。