兔奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解拉萨市一种兔场种兔腹泻死亡的病因,本试验从一只种兔的肠道内容物中分离出一株细菌,通过革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA PCR扩增和序列比对、动物回归试验及药敏试验进行了分析。结果显示,分离菌株为单个或成对的短杆状的革兰氏阴性菌;分离菌与GenBank中奇异变形杆菌的同源性为73.5%～99.8%,采用Mega 7.0软件将分离菌株与11株参考菌株的16S rRNA序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树,综合分析后确定分离菌株为奇异变形杆菌,命名为T2018。在动物回归试验中有3只试验兔出现了腹泻,但均未死亡,剖检结果显示,空肠、回肠肠壁薄而透明,内有半透明胶冻样物;结肠和盲肠黏膜充血,浆膜上有出血斑点。药敏试验显示,分离菌株仅对阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素和喹诺酮类的氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星5种抗菌药表现出高度敏感,对哌拉西林表现为中介,对其他24种抗生素均表现为耐药。上述结果表明该种兔场种兔腹泻死亡的病原为奇异变形杆菌。     

兔奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解拉萨市一种兔场种兔腹泻死亡的病因,本试验从一只种兔的肠道内容物中分离出一株细菌,通过革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA PCR扩增和序列比对、动物回归试验及药敏试验进行了分析。结果显示,分离菌株为单个或成对的短杆状的革兰氏阴性菌;分离菌与GenBank中奇异变形杆菌的同源性为73.5%～99.8%,采用Mega 7.0软件将分离菌株与11株参考菌株的16S rRNA序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树,综合分析后确定分离菌株为奇异变形杆菌,命名为T2018。在动物回归试验中有3只试验兔出现了腹泻,但均未死亡,剖检结果显示,空肠、回肠肠壁薄而透明,内有半透明胶冻样物;结肠和盲肠黏膜充血,浆膜上有出血斑点。药敏试验显示,分离菌株仅对阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素和喹诺酮类的氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星5种抗菌药表现出高度敏感,对哌拉西林表现为中介,对其他24种抗生素均表现为耐药。上述结果表明该种兔场种兔腹泻死亡的病原为奇异变形杆菌。     

犬源奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对吉林省长春地区致犬腹泻的奇异变形杆菌进行流行病学调查及药物敏感性检测,试验采用传统细菌鉴定方法及16S rRNA系统发育学分析方法,对2015—2017年间送检的62份疑似患细菌性肠炎犬的腹泻物进行奇异变形杆菌的分离鉴定及遗传进化分析,并对分离菌进行药物敏感性试验及小鼠致病性试验。结果表明:从送检病料中共分离获得12株奇异变形杆菌(分离率为19.35%),革兰氏染色为阴性,理化特性鉴定与奇异变形杆菌的生理特性基本一致;分离菌经16S rRNA基因扩增获得大小的为1 600 bp条带,所测序列与奇异变形杆菌的核苷酸序列同源性在98%以上,12株分离株处于3个独立分株;其中分离菌对兽医临床常用药物整体耐药水平较高,仅有部分菌株对环丙沙星、恩诺沙星、头孢曲松敏感;分离菌CC15031对小鼠的半数致死量(LD_(50))为2.8×10~6 cfu/mL,具有较强的致病性。说明分离得到的奇异变形杆菌具有较强的耐药性和不同程度的致病性,应引起重视。     

鸡奇异变形杆菌的分离鉴定和16S rRNA基因序列测定与系统进化分析

从山东泰安一鸡场发病雏鸡眼中分离到1株致病菌(编号为QY),通过细菌形态学等常规鉴定符合奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)特性。用奇异变形杆菌阳性血清诊断结果呈阳性,人工感染证明该菌株是造成该鸡场雏鸡大批发病死亡的致病菌。药敏试验结果显示对头孢类、恩诺沙星等高度敏感,而对青霉素和复合磺胺等不敏感。以细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到QY的16SrRNA基因序列,长约1 453bp(GenBank,登录号为GU477712)。将该序列与GenBank中序列进行Blast比对,发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达98%以上。运用DNAStar软件与其中10株奇异变形杆菌分离株构建系统进化树,结果表明,分离株(QY菌株)与10个代表菌株的同源性均为98.9%～99.9%,其中与AB272366同源性最高为99.9%。从分子水平证明该菌是奇异变形杆菌并分析了其遗传进化规律,为鸡奇异变形杆菌的鉴定及其引起的疾病的诊断与治疗提供了参考。     

貉源奇异变形杆菌分离鉴定及系统发育分析

为研究引起貉肺炎的病原,笔者无菌采集病貉肺脏、肝脏、心血等病料,分离出1株细菌并命名为H1,采用形态特征、培养特性、生化鉴定、动物致病性试验等方法进行了相关鉴定,初步确定该分离菌株为奇异变形杆菌(P.mirabilis)。结果表明:该分离菌株对小鼠具有较强致病作用;对H1菌株的16S rRNA序列在NCBI上利用BLAST软件与Gen Bank中公布的12株奇异变形杆菌参考株进行同源性对比分析,同源性为96.5%~99.9%,系统发育树分析发现,分离菌株H1与4株参考株亲缘关系较近,同源性均为99.9%,证明该分离菌株H1为奇异变形杆菌;该菌株对氟苯尼考、头孢曲松和阿奇霉素等高度敏感。     

貉源奇异变形杆菌的分离鉴定及噬菌体的分离

为了研究从山东某貉子养殖场发病貉子采集的病料中分离到的1株致病菌的特性,通过培养特性、形态特征、16S rRNA测序分析等方法对该菌进行了相关鉴定,同时针对该菌进行了药敏试验以及相应噬菌体的分离,并进行了噬菌体的体外裂解性能试验。结果表明:所分离到的致病菌为奇异变形杆菌,分离菌株与GenBank中公布的13株奇异变形杆菌的参考序列同源性为98.1%～100%,其中KJ626258与该菌株同源性最高,为100%;该菌株对阿米卡星、环丙沙星高度敏感。噬菌体体外裂解试验结果表明,作用2.5～5 h的时候,病原菌开始减少,噬菌体开始增多,吸光度开始下降,且当MOI=1∶100时吸光度下降最快。     

山羊奇异变形杆菌分离鉴定及其16S-23S rRNA ISR序列RFLP分析

2012年初,山东菏泽某羊场的羊群发病,从发病羊器官分离到2株病原细菌。对病原细菌进行鉴定,并对其与已知同种异源菌株相似性差异进行分析。从患病山羊内脏器官分离细菌,经形态特征、培养特性、生化试验、血清学试验及致病性试验进行鉴定;再通过设计通用引物扩增16S-23SrRNA ISR(intergenic spacer region)序列,将PCR产物经HinfⅠ单酶切获得3条可视条带,同时对扩增条带中的主带测序并进行系统发育分析。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌;分离菌株同本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌PCR-RFLP结果一致;分离菌株PCR产物同GenBank收录的HI4320株奇异变形杆菌及本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌进行序列比较,分离羊源菌株与兔源菌株相似性为94.8%、与鸡源菌株相似性为96.0%～98.2%,与人源HI4320株相似性为96.9%。研究证实发病羊致病病原为奇异变形杆菌,其与鸡源、兔源和人源奇异变形杆菌的亲缘关系较近。     

一株猪源奇异变形杆菌的分离鉴定

试验通过对阿克苏某生猪养殖场腹泻仔猪肛拭子进行病原分离,并成功分离到一株细菌。细菌纯化后通过革兰氏染色观察其形态结构,并提取其DNA测序。分离菌株得到的基因序列标记为W1,通过DNA star生物软件将菌株W1与国内外菌株进行基因序列对比,并做同源性和进化树分析。结果表明:W1与国内外15株奇异变形杆菌的同源性为96.4%~99.4%,其中与W1同源性最低的是KT216564,与W1同源性最高的是AB272366。遗传进化树分析表明,分离株W1与南京株JF775415处于同一分支,属于奇异变形杆菌,该菌株的成功分离为阿克苏地区对奇异变形杆菌的研究提供参考。     

狐狸流产奇异变形杆菌的分离鉴定及特征分析

为明确引起狐狸流产的主要原因,确定主要病原体并提出有效防控措施,试验收集了河北地区多个流产狐狸的脾脏和卵巢,利用细菌分离培养、形态观察、药敏试验、16S rRNA基因测序和序列分析及同源性比对等方法对引起狐狸流产的病原体进行分离鉴定,分析其耐药性,筛选有效治疗药物;同时对病原菌的致病力进行检测。结果显示,从流产狐狸病变的脾脏和卵巢中分离到了1株单一的革兰氏阴性菌,命名为FOX-abortion-Hebei。药敏试验结果显示,该菌对头孢哌酮等11类药物敏感,而对妥布霉素等5类抗菌药物中度敏感。动物试验结果显示,该菌株具有较强的致病性,攻毒小鼠和狐狸后均可引起动物死亡。16S rRNA测序和同源性分析结果显示,分离到的革兰氏阴性菌为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM),与已公布序列的同源性为93.6%～99.9%;系统进化树结果显示,该菌与埃及分离到的菌株(AUMC B-199)亲缘关系最近。本研究明确了狐狸流产主要是由奇异变形杆菌感染所致,也是首次在流产狐狸中分离到该菌,且能引起严重的繁殖障碍,需在狐狸养殖中加以防控。     

狐狸流产奇异变形杆菌的分离鉴定及特征分析

为明确引起狐狸流产的主要原因,确定主要病原体并提出有效防控措施,试验收集了河北地区多个流产狐狸的脾脏和卵巢,利用细菌分离培养、形态观察、药敏试验、16S rRNA基因测序和序列分析及同源性比对等方法对引起狐狸流产的病原体进行分离鉴定,分析其耐药性,筛选有效治疗药物;同时对病原菌的致病力进行检测。结果显示,从流产狐狸病变的脾脏和卵巢中分离到了1株单一的革兰氏阴性菌,命名为FOX-abortion-Hebei。药敏试验结果显示,该菌对头孢哌酮等11类药物敏感,而对妥布霉素等5类抗菌药物中度敏感。动物试验结果显示,该菌株具有较强的致病性,攻毒小鼠和狐狸后均可引起动物死亡。16S rRNA测序和同源性分析结果显示,分离到的革兰氏阴性菌为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis,PM）,与已公布序列的同源性为93.6%~99.9%;系统进化树结果显示,该菌与埃及分离到的菌株（AUMC B-199）亲缘关系最近。本研究明确了狐狸流产主要是由奇异变形杆菌感染所致,也是首次在流产狐狸中分离到该菌,且能引起严重的繁殖障碍,需在狐狸养殖中加以防控。     

鸭源奇异变形杆菌的分离鉴定及其16 S rRNA基因序列分析

从山东潍坊不同鸭场发病雏鸭肝脏、肺脏病料中分离到3株致病菌,通过培养特性观察、革兰氏染色、生化试验,初步鉴定为奇异变形杆菌。用PCR方法扩增分离菌株的16 S rRNA基因,获得大小为1 504 bp的目的片段。经BLAST比对分析表明,与其同源性最高的均为奇异变形杆菌各株系的16 S rRNA序列,同源性高达98%以上,与14株参考菌的同源性为98.9%~99.8%,在系统发育树上聚为同一枝,表明分离菌株为鸭奇异变形杆菌。动物接种试验表明分离菌株对鸭均具有较强致病性。药敏试验结果显示分离株对头孢吡肟、哌拉西林、氨曲南等8种药物敏感,对米诺环素、头孢曲松、环丙沙星等23种药物有耐药性。     

奇异变形杆菌分离株23S rRNA序列分析

通过PCR反应扩增7株鸡奇异变形杆菌和1株兔奇异变形杆菌的23SrRNA基因片段(1045bp),经克隆测序,用DNA Star分析软件将所获得的序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌、普通变形杆菌以及其他相近属的23S rRNA基因序列进行同源性比较,并由此构建奇异变形杆菌系统进化发生树。结果表示,本实验室保存的7株鸡奇异变形杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与兔奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,与普通变形杆菌的核苷酸序列同源性为95.4%～96.2%,而与其他相近属同源性只有92.9%～93.4%。结果表明,23S rRNA基因序列分析可以作为鉴定奇异变形杆菌的一种快速、简便的方法。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及特征分析

为探究广西地区猪源奇异变形杆菌的毒力和耐药情况,本研究从不同规模养殖场收集病死猪病料98份,通过分离培养、形态学观察、染色镜检、16S rRNA测序对分离菌进行鉴定;采用微量肉汤稀释法进行药敏试验;PCR检测毒力基因、耐药基因和整合子及其可变区;可变区扩增产物克隆至pMD^TM19-T载体进行测序。鉴定结果显示,22株细菌在TSA培养基上弥漫性生长,在SS培养基上形成中心黑色边缘白色的单菌落,镜检为革兰氏阴性短杆菌,变形杆菌属特异性基因（TUF）阳性。16S rRNA测序结果显示,21株分离菌与奇异变形杆菌同源性达99%,1株分离菌与彭氏变形杆菌同源性达99%。药敏结果显示,21株奇异变形杆菌对四环素、多西环素、氨苄西林、磺胺甲噁唑耐药率均为100%,对头孢氨苄、头孢呋辛、头孢噻肟、亚胺培南、卡那霉素耐药率在57.1%以上,所有分离株均为多重耐药菌。PCR结果显示,21株分离菌毒力基因atfA、hpmA、ireA、mrpA、pmfA、rsb、ureC、zapA、ptA检出率均为100%,ucaA检出率为95.2%;ESBLs菌株为bla_TEM型、bla_CTX型或bla_TEM型和bla_CTX型,AmpC菌株均为bla_DHA型,携带ESBLs或AmpC基因的菌株比例为57.1%、14.3%,同时携带ESBLs和AmpC基因的菌株比例为14.3%;qnrA、qnrB、qnrS和aac（6’）-Ⅰb-cr检出率分别为9.5%、0、4.8%和80.1%。21株分离菌Ⅰ类整合子（intⅠ1）阳性率61.9%,检测到9种基因盒阵列（aadA2-linF、estX、dfrA32-ereA-aadA2、drfA5、drfA12-orfF-aadA2、arr3-aac （6’）Ⅰb-cr5、aac （6’）Ⅰb-cr5-bla_OXA-1-catB3-aar3、drfA1-orfC和aadA2）;Ⅱ类整合子（intⅠ2）阳性率76.2%,检测到1种基因盒阵列（drfA1-sat1-aadA1）。本研究结果表明,广西地区猪源奇异变形杆菌毒力高且耐药严重,为后期针对奇异变形杆菌的防治和研究提供数据支持。     

鸡奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏分析

从云南某鸡场发病鸡肝脏中分离到一株革兰氏阴性多形性小杆菌,并进行生理生化鉴定、16SrDNA基因比对鉴定、致病性试验和药敏试验。试验结果表明：该分离株分解葡萄糖、乳糖、半乳糖和木糖,产酸产气,迅速分解尿素,H2S试验阳性,结合分离株的培养特性和革兰氏染色镜检结果,将分离株初步鉴定为鸡奇异变形杆菌;分离株16srDNA核苷酸序列与GenBank上其它鸡奇异变形杆菌之间的同源性高达99％～100％,与ALK428（基因登录号KC456557）为代表的许多奇异变形杆菌菌株之间的核苷酸同源性高达100％,将分离菌株进一步鉴定为鸡奇异变形杆菌;分离株对小白鼠有强致病性,对头孢噻肟敏感,对青霉素、氨苄西林、头孢噻吩、链霉素、卡那霉素、氧氟沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考等多种抗生素表现严重的多重耐药性。     

鸡源致病性奇异变形杆菌的分离鉴定与遗传进化分析

为了解鸡源奇异变形杆菌的耐药情况、致病力和遗传特征,本试验从凉山地区分离得到2株细菌（YLF1、WS）,通过培养特征、镜检特征和16S rRNA序列测定对分离菌进行鉴定及致病性试验;采用（K-B）法检测分离菌对14种常用抗生素（包括β-内酰胺类、头孢烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类）的敏感性;并与GenBank中公布的21种不同来源的变形杆菌16S rRNA基因序列进行遗传进化分析。结果表明,YLF1、WS菌株均具有迁徙性和β-溶血生长特征,镜检为革兰氏阴性长短不一的杆菌或球菌,经16S rRNA基因鉴定与GenBank中奇异变形杆菌同源性均在99%以上,YLF1、WS菌株确定为奇异变形杆菌,均表现为多重耐药,耐药率分别为78.6%（11/14）和71.4%（10/14）;雏鸡致死率均为80%;YLF1、WS菌株与日本人体分离株、中国新疆黄牛分离株和中国广东土壤分离株同源性最高,达99.9%;与来自中国河南、中国新疆及印度的鸡源奇异变形杆菌同源性较高（98.9%~99.3%）,遗传关系密切。表明凉山地区鸡群中存在奇异变形杆菌感染,分离株有较高的致病力和较强的耐药性,也提示分离菌可能来源于环境、感染鸡或其他动物,同时存在人畜共患的潜在危险。     

仔猪腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了对吉林省某规模化养猪场腹泻仔猪肛拭子样品进行病原菌分离鉴定,试验对样品进行细菌分离培养,革兰氏染色、镜检,生化反应及动物回归试验,选取生物过滤后分离获得的部分分离菌利用BD PhoenixTM-100全自动微生物鉴定/药敏系统检测细菌鉴定仪对分离菌株进行药物敏感性检测,同时利用ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)-PCR指纹图谱和融合试验对分离菌株进行流行病学分型检测。结果表明:根据细菌分离培养及染色镜检结果初步分离得到14株奇异变形杆菌。在14株奇异变形杆菌中,选取生物过滤后分离获得的7株奇异变形杆菌进行生化反应和药敏试验。在45种生化反应中,有7种生化反应结果为可变量,生化反应结果与奇异变形杆菌一致率为84. 4%。7株分离菌对氨苄西林、磺胺甲基异口恶唑和环丙沙星的耐药率均达到85. 7%,而对哌拉西林和左氧氟沙星的耐药率均达到42. 9%,具有较高的耐药性。将分离获得的14株奇异变形杆菌培养物腹腔注射Balb/c小鼠,全部小鼠于12 h内死亡,表明14株分离菌均具有高致病性。14株分离菌的ERIC-PCR指纹图谱的鉴定结果与融合试验的结果一致。说明融合试验也可用于检测奇异变形杆菌分离株的同源性,同时本试验分离株的耐药情况严重。     

鸡源致病性奇异变形杆菌的分离鉴定与遗传进化分析

为了解鸡源奇异变形杆菌的耐药情况、致病力和遗传特征,本试验从凉山地区分离得到2株细菌(YLF1、WS),通过培养特征、镜检特征和16SrRNA序列测定对分离菌进行鉴定及致病性试验;采用(K-B)法检测分离菌对14种常用抗生素(包括β-内酰胺类、头孢烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类)的敏感性;并与GenBank中公布的21种不同来源的变形杆菌16SrRNA基因序列进行遗传进化分析。结果表明,YLF1、WS菌株均具有迁徙性和β-溶血生长特征,镜检为革兰氏阴性长短不一的杆菌或球菌,经16SrRNA基因鉴定与GenBank中奇异变形杆菌同源性均在99%以上,YLF1、WS菌株确定为奇异变形杆菌,均表现为多重耐药,耐药率分别为78.6%(11/14)和71.4%(10/14);雏鸡致死率均为80%;YLF1、WS菌株与日本人体分离株、中国新疆黄牛分离株和中国广东土壤分离株同源性最高,达99.9%;与来自中国河南、中国新疆及印度的鸡源奇异变形杆菌同源性较高(98.9%~99.3%),遗传关系密切。表明凉山地区鸡群中存在奇异变形杆菌感染,分离株有较高的致病力和较强的耐药性,也提示分离菌可能来源于环境、感染鸡或其他动物,同时存在人畜共患的潜在危险。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为了对河南省某猪场疑似细菌感染病例进行确诊,本试验采集了病猪肠道中的样品从中分离到1株革兰阴性短杆菌,进行了培养特性观察、生化试验、药敏试验以及16S rRNA基因序列分析。结果显示,分离菌的生化特性、培养特性基本符合奇异变形杆菌的特征,16S rRNA基因序列与奇异变形杆菌的同源性在98%以上,将该分离菌株命名为ZB17;序列分析表明,该分离菌株与猪源奇异变形杆菌(HQ259935.1和KR133627.1)的同源性最高,与大肠杆菌、沙门菌,克雷伯菌的同源性相对较低;分离株具有较强的致病性和多重耐药性,对复达欣、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星敏感;但对氨苄西林、美洛西林、先锋霉素IV、先锋霉素V、先锋霉素VI、卡那霉素、新霉素、四环素、强力霉素耐药。本试验为猪源奇异变形杆菌的分离、鉴定及治疗提供了参考。     

1株竹鼠奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏分析

为确定广东某竹鼠养殖场发生竹鼠死亡的原因,本研究从发病竹鼠血液和组织中分离到可疑细菌,并对分离的菌株进行革兰氏染色、生化特性分析和16S rRNA基因鉴定及序列分析,同时进行药敏试验。结果显示:分离的细菌为杆状、球状和球杆状形状不一的革兰氏阴性菌;生化特性与奇异变形杆菌基本一致;16S rRNA序列与NCBI数据库中奇异变形杆菌16S rRNA核苷酸相似性为99%以上。结果表明,该分离细菌为奇异变形杆菌将其命名为GD/ZS-01株;药敏实验显示,该菌株对头孢哌酮、丁胺卡那和左氧氟沙星高度敏感。本研究结果为竹鼠养殖场疫情的防治提供了科学参考。     

水貂奇异变形杆菌的分离鉴定及16S rRNA基因序列分析

从辽宁某貂场发病水貂中分离到1株致病菌,命名为PMSD株,通过形态学观察和生化试验等常规鉴定发现符合奇异变形杆菌特性,进一步经VITEK 2Compact 30全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定该株细菌为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示PMSD株对氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物等敏感,而对β-内酰胺类药物和磺胺类药物等不敏感。以细菌16SrRNA基因为模板应用通用引物进行PCR扩增,得到PMSD株的16SrRNA基因序列,长约1 504bp,提交到GenBank中,登录号:KM229530。将该序列与GenBank中序列进行BLAST比对,结果发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达99%以上。选取其中前20株作为参考序列,运用生物学软件构建系统发育树并进行同源性比对,结果表明,分离菌PMSD株与20个代表菌株的同源性为98.9%~99.7%,其中与BB2000株、HI4320株、B1株和FCC141株同源性最高,为99.7%。本研究为预防和控制奇异变形杆菌引起的水貂疾病奠定了一定的基础。