不同动物源性维氏气单胞菌气溶素基因的克隆及比较分析

为系统研究维氏气单胞菌毒力因子气溶素,对不同动物源性的维氏气单胞菌气溶素基因（aerA）进行了克隆,获得了1500 bp左右的目的基因,并对其序列进行了分析比较。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌aerA基因的核苷酸序列均具有APT Superfamily与Aerolysin Superfamily保守结构域,其核苷酸序列的同源性在95.8%以上,编码的氨基酸序列同源性在89.8%以上,说明不同源性维氏气单胞菌气溶素具有一定的保守性。该研究结果可为维氏气单胞菌的检测及疫苗制备提供一定的理论依据。     

框镜鲤维氏气单胞菌溶血素基因片段的克隆与序列分析

本试验对维氏气单胞菌的溶血素基因片段进行PCR扩增、测序后分析,结果表明,维氏气单胞菌的溶血素基因片段序列与气单胞菌属的不同菌种的溶血素基因具有很高的同源性;其编码蛋白的二级结构预测:α螺旋与β转角占有很高的比例,可能有4区域形成B细胞表位.     

3株维氏气单胞菌耐药性及毒力基因的比较

为探究不同地区的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）耐药性及毒力基因是否存在区别,本研究从生长形态、生化试验、药敏试验、人工感染试验、16S rDNA基因测序同源性分析及毒力基因等方面比较了草鱼源菌株GZCY2019、杂交鲟源菌株GZXY2018及斑点叉尾鮰源菌株GZBD2017的差异。结果显示,3株不同源维氏气单胞菌在鲜血平板上均为圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围均有β溶血环;革兰氏染色镜检均为两端钝圆短小阴性杆菌;药敏试验显示,3株菌对丁胺卡那、多西环素等药物均敏感,而对复方新诺明、头孢他啶、多黏菌素B等药物均中度敏感,对其他药物则表现出不同程度的敏感性或者耐药性;人工感染试验显示,菌株GZCY2019与GZBD2017对小鼠累计死亡率为100%,菌株GZXY2018的累计死亡率为80%;16S rDNA同源性分析显示,菌株GZCY2019与菌株GZBD2017同源性为99.9%,二者与菌株GZXY2018同源性均为97.1%;毒力基因检测结果显示,3株菌均携带热不稳定性肠毒素（Alt）、溶血素（hlyA）与鞭毛（Fla）等毒力基因,而对细胞毒性肠毒素（Act）及其热稳定性肠毒素（Ast）毒力基因的携带则表现不同。本研究通过不同源维氏气单胞菌的对比发现,3株菌在生长形态、染色镜检结果、生化结果上基本相似,但耐药性和毒力基因的携带存在较大差异。     

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AopN蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank上登陆的嗜水气单胞菌AH-1株Ⅲ型分泌系统aopN基因序列,设计1对特异性引物,以J-1株的基因组为模板,PCR扩增得到aopN基因,连入pET-32a(+),转化至大肠杆菌表达,同时PCR检测aopN基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。aopN基因测序分析发现,片段长度为874 bp,与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、81%、82%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为81%,与温和气单胞菌的同源性为82%。PCR检测结果表明,57株能检测到aopN基因的目的片段。SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量为54.5ku,用兔抗J-1株的全菌抗血清进行Western blot分析表明,该蛋白具有较好的免疫反应性。由于多数菌株都含有aopN基因,提示AopN可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。     

维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达

本试验旨在利用大肠杆菌BL21（DE3）表达维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性。根据GenBank公布的序列设计1对引物,经PCR扩增获得flaA基因的完整开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达和纯化。SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌成功表达,约在38 ku处可见清晰的表达产物,诱导产物大小与理论值相符。经Western blotting检测,结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体和His-tag抗体发生免疫反应。因此,本试验成功表达了维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,为进一步研究其生物学功能及免疫佐剂作用奠定了基础。     

猪囊尾蚴抗原基因Ag1V1的克隆及其序列分析

根据NCBI上已知序列设计引物,利用RT-PCR技术从猪囊尾蚴中成功克隆了低分子量抗原基因Ag1V1,同源性和种系发育分析结果显示,河南分离株Ag1V1基因的核苷酸序列和预测氨基酸序列与日本分离株同源性为100％和98.9％,说明Ag1V1蛋白基因具有一定的保守性;通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原.     

维氏气单胞菌研究进展

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）渐已成为重要的人-鱼共患致病菌。文章简单介绍了其分类地位及常规和特殊的生物学性质,并进一步综述了该菌的毒力因子、鉴定方法、流行病学和疫苗研究。作为气单胞菌属的成员,维氏气单胞菌具有该属典型的毒力因子,如气溶素、肠毒素、一系列粘附因子、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶和核酸酶等。目前,维氏气单胞菌的鉴定主要依靠生理生化方法,也有人应用分子生物学和免疫学方法鉴定。维氏气单胞菌对水产动物有相当高的致死率,患有肝胆疾病的人感染后常常产生严重的后果,需要加强针对该菌所致疾病的诊断。在疫苗研究方面,有学者研究了口服疫苗和DNA疫苗,达到了一定的免疫效果。     

斑点叉尾鮰源致病性维氏气单胞菌的分离与生物学特性鉴定

为鉴定一起致斑点叉尾鮰突然发病死亡的病原，本研究从发病斑点叉尾鮰中分离到1株致病菌GZTL2017，通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、动物回归试验、生化试验、16S rDNA序列分析、部分毒力基因检测和药敏试验进行鉴定。临床解剖观察结果显示，患病斑点叉尾鮰呈现体表溃疡、鳍根部出血、烂腮、肠管充血等症状；分离菌在培养基中呈现表面湿润凸起、边缘光滑半透明、形态均一的乳白色菌落；革兰氏染色镜检显示，分离菌为单个或成双存在、两端钝圆的短直阴性杆菌；动物回归试验显示，该分离菌有较强的致病性；生化试验结果显示，分离菌具有运动性，且氧化酶、V-P、赖氨酸脱氢酶等反应阳性，精氨酸双水解酶、硫化氢等反应阴性；16S rDNA基因序列系统进化树显示，该菌与维氏气单胞菌聚为一支，同源性均>99%；毒力基因检测结果显示，该菌能检出气溶素基因（Aer）、黏附素基因（Aha）、外膜蛋白基因（OmpA）3种毒力基因；药敏试验结果显示，该菌对氟苯尼考、强力霉素、氧氟沙星等14种药物敏感；对诺氟沙星、新霉素、万古霉素等7种药物中度敏感；对麦迪霉素、苯唑西林、头孢拉定等8种药物耐药，且对氟苯尼考、强力霉素的药物最小抑菌浓度分别为1和2 μg/mL。本试验成功分离到1株维氏气单胞菌，为斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病防治提供参考依据。     

维氏气单胞菌TH0426株ompW基因的克隆、生物信息学分析及其原核表达

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)ompW基因的生物信息学特性及相关功能,试验克隆了维氏气单胞菌ompW基因片段,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级及三级结构,并对其进行原核表达及反应原性检测。结果显示,ompW基因全长594 bp,编码197个氨基酸,TH0426株ompW基因与A.veronii B5B6株属于同一分支;该蛋白属于外膜蛋白,在19～29位氨基酸之间有一个典型的疏水区域,不存在跨膜区、信号肽,二级结构以β折叠与无规则卷曲为主。Western blot结果显示OmpW重组蛋白能与鼠抗维氏气单胞菌(A.veronii)TH0426株血清发生特异性结合。综上,OmpW重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究A.veronii疫苗奠定基础。     

维氏气单胞菌RCR快速检测方法的建立及初步应用

以维氏气单胞菌的核酸酶基因为靶基因建立了PCR快速检测方法。实验证明该方法具有良好的特异性与敏感性,对维氏气单胞菌基因组DNA的最低检测浓度为1.58×10-4ng;在人工模拟试验的30份样品中:使用PCR检测方法的样本检出率达到了86.7%(26/30),高于细菌分离培养的检出率73.3%(22/30)。该方法的建立为维氏气单胞菌的快速检测提供了新的方法。     

兔豆状囊尾蚴Tp14基因的克隆及其序列分析

为鉴定兔豆状囊尾蚴(C.pisiformis)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从C.pisiformis总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。     

狐狸源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

本研究通过生物学特性、16S rRNA基因和4种等看家基因的序列测定与分析,对分离自北京动物园死亡狐狸病变组织的1株细菌进行鉴定,并对其进行小鼠致病力试验及药物敏感性试验。结果显示:该细菌为革兰氏阴性杆菌,培养特性、理化反应与维氏气单胞菌温和生物型基本相同;根据16S rRNA基因和dnaJ、rpoD、gyrB、cpn60等看家基因的系统进化及其同源性分析,确定所分离的细菌与维氏气单胞菌属于同一系统发育分支,各基因同源性最高分别为97.6%～99.9%。分离菌株对CD-1小鼠有较强的致病作用,其半数致死量为2.8×105cfu/只;对氧氟沙星、头孢他啶等14种抗菌药物敏感,对青霉素G、克林霉素等9种抗菌药物耐药。     

Ⅰ群禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

在同源性分析基础上,确定了12个血清型penton蛋白同源性最高的2段基因并通过linker进行连接,以该串联基因原核表达蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备并筛选到2株可分泌FAdV-Ⅰ penton蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(Mab-penton-6#和Mab-penton-9#).2株单克隆抗体小鼠腹水经间接...     

花斑副沙鳅源致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药物敏感性分析

为了对引起养殖花斑副沙鳅(Parabotia fasciata Dabry)幼鳅死亡的分离菌株(XQS1)进行鉴定,本研究对其进行了生理生化分析、16S rRNA基因和gyr B基因序列测定及系统进化树分析。结果显示,该致病菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)形态特征以及生理生化特性相似,通过对其16S rRNA基因和gyr B基因序列比对及进化树分析,显示该菌株与GenBank中维氏气单胞菌相关基因序列的一致性均在98%以上,而且在系统进化树中与维氏气单胞菌聚为一簇,综合以上结果确定该致病菌为维氏气单胞菌。溶血性分析和毒力基因检测结果显示,菌株XQS1能够使兔血平板呈β溶血,并携带了act、alt、aer、hlyA毒力基因,进一步证实了该菌株具有较强的致病性。药敏结果显示,该菌株对多西环素、诺氟沙星、氧氟沙星、氟苯尼考等药物敏感,而对其它药物中度敏感或耐药。本研究首次报道了维氏气单胞菌对人工养殖花斑副沙鳅的危害,并为临床上该病的防治提供了药物参考,对花斑副沙鳅产业化养殖具有重要意义。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性分析

为探究温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性,试验采用PCR法检测10株来源不同的鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类抗生素的4种耐药基因（aph（3'）-Ⅱa、ant（3″）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb、aac（3）-Ⅱa）及四环素类抗生素的3种耐药基因（tetA、tetC、tetM）的表达情况,并利用K-B纸片扩散法对6种抗生素进行耐药表型分析。结果显示,10株温和气单胞菌对氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-Ⅱa、ant（3″）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb的检出率分别为20%、30%、20%,未检测出aac（3）-Ⅱa基因;对四环素类的耐药基因tetA、tetC、tetM的检出率分别为70%、20%、60%。K-B纸片扩散法结果显示,10株菌对四环素耐药率最高,对链霉素敏感,对庆大霉素、卡那霉素、多西环素、米诺环素高度敏感。结果表明,本次分离的温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素具有一定的耐药性,为深入了解温和气单胞菌的耐药机制提供参考。     

鱼源维氏气单胞菌的耐药性研究

为检测7株鱼源维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的耐药基因和耐药表型的分布情况,试验采用PCR法检测分离株中氨基糖苷类耐药基因(aac(3)-Ⅱa、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰa和aph(3')-Ⅱa),磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2和Sul3)和四环素类耐药基因(tetA、tetC和tetM),运用Kirby-Bauer纸片扩散法检测7株鱼源维氏气单胞菌分离株对22种常用抗生素的敏感性。结果表明,可检出耐药基因aac(3)-Ⅱa(71.4%)、aac(6')-Ⅰb(85.7%)、Sul2(85.7%)和tetA(28.5%);未检出ant(3")-Ⅰa、aph(3')-Ⅱa、Sul1、Sul3、tetC和tetM基因。7株维氏气单胞菌对磷霉素(100%)、多黏霉素B(100%)、痢特灵(85.7%)、奥复星(71.4%)较敏感;对氨苄西林(100%)、乙酰螺旋霉素(100%)、复方新诺明(85.7%)、磺胺异恶唑(85.7%)、四环素(85.7%)等耐药。这说明耐药基因和耐药表型之间存在一定的相关性。     

维氏气单胞菌JLL-1株外膜蛋白的原核表达及其免疫原性检测

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)的免疫原性,本试验对A.veronii的OmpAⅠ基因进行克隆,构建了原核表达质粒pET-30a(+)-OmpAⅠ,并转入大肠杆菌BL21(DE3),将其表达后纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。将灭活苗、弗氏佐剂(OmpAⅠ)、纯化蛋白及PBS缓冲液分别免疫鲤鱼后,检测每周各试验组鱼体血清非特异性免疫指标(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活力)及特异性IgM抗体水平变化情况,并于加强免疫2周后对鲤鱼进行攻毒保护性试验。结果显示:重组蛋白免疫鲤鱼后能产生明显的免疫反应,保护率在77%以上;受免鲤鱼血清中IgM抗体水平、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及超氧化物歧化酶活力活力较对照组有显著提高。结果表明,重组蛋白OmpAⅠ具有较好的免疫原性和保护作用,为进一步研究外膜蛋白基因工程疫苗的开发奠定基础。     

维氏气单胞菌灭活疫苗的制备及对锦鲤免疫效果评价

为证明维氏气单胞菌灭活疫苗对锦鲤机体的免疫效果,应用福尔马林灭活法制备了维氏气单胞菌灭活疫苗对免疫后的锦鲤进行酸性磷酸酶活力检测、超氧化物歧化酶活力检测、吞噬活力等各项免疫指标的检测,并于试验第5周进行免疫保护力试验。结果显示,酸性磷酸酶活力在试验开始后有所上升,在第2周达到最高;超氧化物歧化酶活力上升,并在第2周达到最高;经观察,第3周开始白细胞的数量增多,吞噬活性同时增大;抗体效价于第3周达到最大值,并持续一段时间;免疫4周后攻菌检测免疫保护力,测得试验组的相对免疫保护率RPS为86.4%。上述结果表明,维氏气单胞菌灭活疫苗能够诱导锦鲤机体产生免疫应答反应,并能形成一定保护力。     

鱼源嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌PCR-RFLP鉴别方法的建立

嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌是鱼类常见条件致病菌,采用传统的形态分类和生理生化反应进行鉴别费时费力,有时还会错误判断,为了提高鉴别效率和准确率,有必要建立一种快速鉴别两种细菌的分子生物学方法。选取12株鱼源致病气单胞菌使用细菌16SrDNA通用引物扩增细菌目的片段,将所测得序列校正后构建系统发育树以明确菌种,并依据种间序列差异筛选合适的限制性核酸内切酶,对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌进行PCR-RFLP酶切图谱的鉴别分析。筛选出嗜水气单胞菌16SrDNA的特异性限制性核酸内切酶SnaBⅠ和可以鉴别维氏气单胞菌的限制性核酸内切酶BseNⅠ,建立了一种快速鉴别嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的PCR-RFLP方法。研究结果对于淡水养殖鱼类嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌细菌性病害的病原快速鉴别具有参考和应用价值。