鲫鱼金黄杆菌的分离、生理生化鉴定及分子生物学鉴定

为了鉴定从发病鲫鱼中分离出的优势菌株(菌株命名为L1),试验以细菌形态观察、生理生化特性分析等传统细菌鉴定法以及16S rDNA扩增和MEGA 5.0软件构建系统进化树的分子生物学鉴定法对优势菌株L1进行鉴定。结果表明:该菌株为不具有运动性的革兰氏阴性菌;生理生化鉴定结果显示与金黄杆菌基本一致;从L1菌株中获得长度为1 406 bp的16S rDNA基因,得到的Gen Bank登录号为KY460509;系统进化树分析显示,与金黄杆菌亲缘关系最近。说明从发病鲫鱼中分离出的优势菌株L1为金黄杆菌。     

鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性分析

为探究温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性,试验采用PCR法检测10株来源不同的鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类抗生素的4种耐药基因（aph（3'）-Ⅱa、ant（3″）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb、aac（3）-Ⅱa）及四环素类抗生素的3种耐药基因（tetA、tetC、tetM）的表达情况,并利用K-B纸片扩散法对6种抗生素进行耐药表型分析。结果显示,10株温和气单胞菌对氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-Ⅱa、ant（3″）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb的检出率分别为20%、30%、20%,未检测出aac（3）-Ⅱa基因;对四环素类的耐药基因tetA、tetC、tetM的检出率分别为70%、20%、60%。K-B纸片扩散法结果显示,10株菌对四环素耐药率最高,对链霉素敏感,对庆大霉素、卡那霉素、多西环素、米诺环素高度敏感。结果表明,本次分离的温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素具有一定的耐药性,为深入了解温和气单胞菌的耐药机制提供参考。     

枯草芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌对鲫鱼免疫机能的影响及其代谢产物的抑菌活性研究

为了检测枯草芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌对鲫鱼免疫机能的影响及其代谢产物对小肠耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性,试验将鲫鱼分成3组,分别为沼泽红假单胞菌组、等比例沼泽红假单胞菌和枯草芽孢杆菌的复合菌组和未加菌处理的对照组,在养殖水体中分别加入不同的微生物,在第30天静脉采血,测定血浆中碱性磷酸酶(ALP)、总超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)的活性以及丙二醛(MDA)的浓度;利用超声波破碎细胞,旋蒸浓缩得到枯草芽孢杆菌和沼泽红假单胞菌胞内外代谢产物,采用牛津杯法以小肠耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌株,测定代谢产物的抑菌圈直径。结果表明:沼泽红假单胞菌组与复合菌组的鲫鱼血浆中ALP的活性显著高于对照组(P0.05),LZM活性高于对照组,MDA的浓度低于对照组,SOD的活性与对照组的差异不显著(P0.05);两种菌的胞外代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强,沼泽红假单胞菌胞内代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强,枯草芽孢杆菌胞内代谢产物对小肠耶尔森氏菌抑菌活性较强。说明沼泽红假单胞菌和复合菌对鲫鱼的免疫机能有一定的增强作用,两种益生菌胞内外代谢产物对小肠耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑制作用。     

金川牦牛BCL2A1基因克隆及生物信息学分析

为探讨金川牦牛抗凋亡因子--B淋巴细胞瘤2相关蛋白A1（B cell lymphoma 2 related A1，BCL2A1）基因特点，本试验采用PCR方法以金川牦牛血液DNA为模板扩增BCL2A1基因，用DNAStar、ExPASy、ABCpred等生物信息学软件分析基因序列和蛋白质结构。结果显示，克隆获得的片段长622 bp，GenBank登录号：MG459158，开放阅读框为516 bp，共编码171个氨基酸，其中缬氨酸（V）、赖氨酸（K）的含量较多，分别为9.4%和8.8%。BCL2A1分子质量为19.46 ku，理论等电点为4.99，不稳定系数为17.44，具有跨膜螺旋结构域（Scores>500）。二级结构主要为α-螺旋，占60.82%，有一个BCL2结构域，三级结构模型与人BCL2A1同源性最高（72.79%），BCL2A1存在潜在的B细胞抗原表位。与野牦牛氨基酸序列进行比对显示，金川耗牛BCL2A1存在5个氨基酸差异位点。NJ法系统进化分析显示，金川牦牛与野牦牛同源性为98.5%，亲缘关系最近。本试验成功克隆了金川牦牛BCL2A1基因，其在哺乳动物中具有较高的保守性，为深入研究牦牛BCL2A1基因功能提供理论依据。     

鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性分析

为探究温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性,试验采用PCR法检测10株来源不同的鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类抗生素的4种耐药基因(aph(3′)-Ⅱa、ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱa)及四环素类抗生素的3种耐药基因(tetA、tetC、tetM)的表达情况,并利用K-B纸片扩散法对6种抗生素进行耐药表型分析。结果显示,10株温和气单胞菌对氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-Ⅱa、ant(3″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb的检出率分别为20%、30%、20%,未检测出aac(3)-Ⅱa基因;对四环素类的耐药基因tetA、tetC、tetM的检出率分别为70%、20%、60%。K-B纸片扩散法结果显示,10株菌对四环素耐药率最高,对链霉素敏感,对庆大霉素、卡那霉素、多西环素、米诺环素高度敏感。结果表明,本次分离的温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素具有一定的耐药性,为深入了解温和气单胞菌的耐药机制提供参考。     

金川牦牛BCL2A1基因克隆及生物信息学分析

为探讨金川牦牛抗凋亡因子——B淋巴细胞瘤2相关蛋白A1(B cell lymphoma 2related A1,BCL2A1)基因特点,本试验采用PCR方法以金川牦牛血液DNA为模板扩增BCL2A1基因,用DNAStar、ExPASy、ABCpred等生物信息学软件分析基因序列和蛋白质结构。结果显示,克隆获得的片段长622bp,GenBank登录号:MG459158,开放阅读框为516bp,共编码171个氨基酸,其中缬氨酸(V)、赖氨酸(K)的含量较多,分别为9.4%和8.8%。BCL2A1分子质量为19.46ku,理论等电点为4.99,不稳定系数为17.44,具有跨膜螺旋结构域(Scores500)。二级结构主要为α-螺旋,占60.82%,有一个BCL2结构域,三级结构模型与人BCL2A1同源性最高(72.79%),BCL2A1存在潜在的B细胞抗原表位。与野牦牛氨基酸序列进行比对显示,金川耗牛BCL2A1存在5个氨基酸差异位点。NJ法系统进化分析显示,金川牦牛与野牦牛同源性为98.5%,亲缘关系最近。本试验成功克隆了金川牦牛BCL2A1基因,其在哺乳动物中具有较高的保守性,为深入研究牦牛BCL2A1基因功能提供理论依据。     

枯草芽孢杆菌对氨氮应答的转录组及sRNA分析

为探索枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)脱氮的分子机制，筛选枯草芽孢杆菌对氨氮的分子生态学应答相关候选基因及small RNA(sRNA)，本研究对处于富含氨氮环境和对照组的枯草芽孢杆菌R47进行原核链特异性转录组及sRNA分析，并采用Real-time PCR方法检测差异表达基因的相对表达量。结果显示，平均每个测序样本得到约1.40×107条reads。对照组与处理组DESeq2分析得到3918个差异表达基因，并富集在KEGG数据库中的176个信号通路，其中，包括8个与适应富含氨氮环境相关的信号通路(细菌双组分系统通路、精氨酸生物合成、嘌呤代谢等)，同时发现，epsA、tasA、sinR、glnR、glnA、tnrA和ureABC基因可能参与枯草芽孢杆菌对氨氮的应答过程。经sRNA分析获得已注释的枯草芽孢杆菌sRNA 62条。对sRNA靶基因的分析结果显示，其有3960个对应的潜在靶基因，主要参与碳水化合物运输和新陈代谢、氨基酸转运和代谢、转录过程，其中，sRNA2073和sRNA2182对应的靶基因分别为sinR和tnrA。Real-time PCR结果显示，argH、codY、argG、glnA和glnR基因的相对表达量变化与转录组测序结果一致。本研究为进一步探究枯草芽孢杆菌污水脱氮的分子机理提供参考数据。