温和气单胞菌RC-07-KA株溶血素基因克隆、表达及活性检测

为研究温和气单胞菌(A.sobria)溶血素基因的特性,本研究根据GenBank登录的气单胞菌属溶血素基因序列设计一对引物,经PCR扩增得到大小约1.5kb的A.sobria RC-07-KA株溶血基因片段,将该片段克隆到pGEM-T载体,测序结果显示:溶血素基因片段大小为1 467 bp,编码487个氨基酸残基,遗传进化分析结果表明该基因与气单胞菌属中的A.hydrophila菌株Sb (AY611033)、NLEPA-1607 (AF410466)、AEF (HM853019),A.sobria菌株357 (AY157998)、人源分离株(EF620533)和A.salmonicida菌株17-2 (X65048)的溶血素基因亲缘关系较近,同源性大于95％,而与其他菌株的同源性较低.通过构建溶血素重组表达质粒pET-HIy,诱导表达并通过western blot鉴定表达蛋白,结果显示重组菌能高效表达重组溶血素,而且纯化的重组溶血素具有溶解鲤鱼红细胞的活性.为该菌进一步深入研究奠定了基础.     

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株OMPAⅠ基因的克隆及生物信息学分析

为鉴定维氏气单胞菌（Aeromonas veronii,AV）吉林分离株合适的诊断或免疫用抗原,研究依据GenBank维氏气单胞菌外膜蛋白AⅠ基因（OMPAⅠ）设计引物,通过PCR成功扩增出长度为1 026 bp的基因片段,通过序列分析表明：该基因与维氏气单胞菌AB2902300 OMPAⅠ的同源性为93%,与其他气单胞菌同源性大于80%;同时通过生物信息学软件对其蛋白的分子特征进行了预测,为OMPAⅠ可能做为诊断或免疫用抗原提供了理论依据。     

花斑副沙鳅源致病性维氏气单胞菌的分离、鉴定及药物敏感性分析

为了对引起养殖花斑副沙鳅(Parabotia fasciata Dabry)幼鳅死亡的分离菌株(XQS1)进行鉴定,本研究对其进行了生理生化分析、16S rRNA基因和gyr B基因序列测定及系统进化树分析。结果显示,该致病菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)形态特征以及生理生化特性相似,通过对其16S rRNA基因和gyr B基因序列比对及进化树分析,显示该菌株与GenBank中维氏气单胞菌相关基因序列的一致性均在98%以上,而且在系统进化树中与维氏气单胞菌聚为一簇,综合以上结果确定该致病菌为维氏气单胞菌。溶血性分析和毒力基因检测结果显示,菌株XQS1能够使兔血平板呈β溶血,并携带了act、alt、aer、hlyA毒力基因,进一步证实了该菌株具有较强的致病性。药敏结果显示,该菌株对多西环素、诺氟沙星、氧氟沙星、氟苯尼考等药物敏感,而对其它药物中度敏感或耐药。本研究首次报道了维氏气单胞菌对人工养殖花斑副沙鳅的危害,并为临床上该病的防治提供了药物参考,对花斑副沙鳅产业化养殖具有重要意义。     

不同动物源性维氏气单胞菌气溶素基因的克隆及比较分析

为系统研究维氏气单胞菌毒力因子气溶素,对不同动物源性的维氏气单胞菌气溶素基因（aerA）进行了克隆,获得了1500 bp左右的目的基因,并对其序列进行了分析比较。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌aerA基因的核苷酸序列均具有APT Superfamily与Aerolysin Superfamily保守结构域,其核苷酸序列的同源性在95.8%以上,编码的氨基酸序列同源性在89.8%以上,说明不同源性维氏气单胞菌气溶素具有一定的保守性。该研究结果可为维氏气单胞菌的检测及疫苗制备提供一定的理论依据。     

3株维氏气单胞菌耐药性及毒力基因的比较

为探究不同地区的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）耐药性及毒力基因是否存在区别,本研究从生长形态、生化试验、药敏试验、人工感染试验、16S rDNA基因测序同源性分析及毒力基因等方面比较了草鱼源菌株GZCY2019、杂交鲟源菌株GZXY2018及斑点叉尾鮰源菌株GZBD2017的差异。结果显示,3株不同源维氏气单胞菌在鲜血平板上均为圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围均有β溶血环;革兰氏染色镜检均为两端钝圆短小阴性杆菌;药敏试验显示,3株菌对丁胺卡那、多西环素等药物均敏感,而对复方新诺明、头孢他啶、多黏菌素B等药物均中度敏感,对其他药物则表现出不同程度的敏感性或者耐药性;人工感染试验显示,菌株GZCY2019与GZBD2017对小鼠累计死亡率为100%,菌株GZXY2018的累计死亡率为80%;16S rDNA同源性分析显示,菌株GZCY2019与菌株GZBD2017同源性为99.9%,二者与菌株GZXY2018同源性均为97.1%;毒力基因检测结果显示,3株菌均携带热不稳定性肠毒素（Alt）、溶血素（hlyA）与鞭毛（Fla）等毒力基因,而对细胞毒性肠毒素（Act）及其热稳定性肠毒素（Ast）毒力基因的携带则表现不同。本研究通过不同源维氏气单胞菌的对比发现,3株菌在生长形态、染色镜检结果、生化结果上基本相似,但耐药性和毒力基因的携带存在较大差异。     

一株草鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了鉴定贵州芩巩县某养殖场草鱼发病死亡的病原,本研究通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、生化鉴定、药敏试验、动物回归试验、16S rDNA与gyr B基因测序及系统分析进行鉴定。结果显示,本研究从发病草鱼体内分离到1株致病菌GZQG2019,分离菌在培养基中呈圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围呈现β-溶血环;革兰氏镜检显示,分离菌呈两端钝圆短小阴性杆菌;16S rDNA、gyr B基因序列分析显示,分离菌与维氏气单胞菌聚为一支,同源性均在99%以上;药敏试验结果显示,在使用的20种抗菌药物中,该菌对四环素、丁胺卡那、多黏菌素B和头孢曲松等10种药物敏感,对苯唑西林、青霉素、阿莫西林和庆大霉素等8种药物中度敏感,对头孢氨苄、复方新诺明2种药物耐药;动物回归试验显示,该菌对健康草鱼具有强致病性;10种毒力基因扩增结果显示,分离菌携带气溶素、热不稳定性肠毒素、溶血素、核酶、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶和酯酶7种毒力基因。本试验成功分离到1株草鱼源维氏气单胞菌,具有较强毒力,且携带多种毒力因子;对四环素、丁胺卡那等药物敏感,对四环素、丁胺卡那等耐药,为维氏气单胞菌病临床用药提供参考依据。     

维氏气单胞菌TH0426株ompW基因的克隆、生物信息学分析及其原核表达

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)ompW基因的生物信息学特性及相关功能,试验克隆了维氏气单胞菌ompW基因片段,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级及三级结构,并对其进行原核表达及反应原性检测。结果显示,ompW基因全长594 bp,编码197个氨基酸,TH0426株ompW基因与A.veronii B5B6株属于同一分支;该蛋白属于外膜蛋白,在19～29位氨基酸之间有一个典型的疏水区域,不存在跨膜区、信号肽,二级结构以β折叠与无规则卷曲为主。Western blot结果显示OmpW重组蛋白能与鼠抗维氏气单胞菌(A.veronii)TH0426株血清发生特异性结合。综上,OmpW重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究A.veronii疫苗奠定基础。     

一株草鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了鉴定贵州芩巩县某养殖场草鱼发病死亡的病原,本研究通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、生化鉴定、药敏试验、动物回归试验、16S rDNA与gyr B基因测序及系统分析进行鉴定。结果显示,本研究从发病草鱼体内分离到1株致病菌GZQG2019,分离菌在培养基中呈圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围呈现β-溶血环;革兰氏镜检显示,分离菌呈两端钝圆短小阴性杆菌;16S rDNA、gyr B基因序列分析显示,分离菌与维氏气单胞菌聚为一支,同源性均在99%以上;药敏试验结果显示,在使用的20种抗菌药物中,该菌对四环素、丁胺卡那、多黏菌素B和头孢曲松等10种药物敏感,对苯唑西林、青霉素、阿莫西林和庆大霉素等8种药物中度敏感,对头孢氨苄、复方新诺明2种药物耐药;动物回归试验显示,该菌对健康草鱼具有强致病性;10种毒力基因扩增结果显示,分离菌携带气溶素、热不稳定性肠毒素、溶血素、核酶、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶和酯酶7种毒力基因。本试验成功分离到1株草鱼源维氏气单胞菌,具有较强毒力,且携带多种毒力因子;对四环素、丁胺卡那等药物敏感,对四环素、丁胺卡那等耐药,为维氏气单胞菌病临床用药提供参考依据。     

杂交鲟维氏气单胞菌的分离鉴定及其耐药性分析

试验旨在对贵州省某养鱼场发病杂交鲟体内分离的优势菌株进行鉴定、致病力探究及耐药性分析。本试验通过革兰染色、生化鉴定、细菌16S rDNA基因分析、动物回归试验、药敏试验、部分毒力基因检测与耐药基因检测。结果显示:分离菌为革兰阴性短杆菌,细菌16S rDNA扩增测序与比对,得大小为1 477 bp的片段,其片段基因序列与GenBank中的维氏气单胞菌序列相似度达99.00%,药敏试验显示:分离菌对环丙沙星、氟苯尼考、头孢哌酮等药物敏感,对四环素、磺胺异唑、苯唑西林药物出现耐药,耐药基因检测显示:分离菌含有耐磺胺基因(Sul1,sul2)、Ⅰ类整合子(Intl1)3种耐药基因,毒力基因检测显示:分离菌含有气溶素(Aer)和粘附素(Aha)两种毒力基因。综合本试验结果,分离菌为维氏气单胞菌(A.veronii),含有毒力基因,并对环丙沙星、氟苯尼考、头孢哌酮等药物敏感。本试验对贵州地区鲟发病流行的病因做出准确诊断,为该地区细菌性鱼病预防与合理用药提供依据。     

维氏气单胞菌RCR快速检测方法的建立及初步应用

以维氏气单胞菌的核酸酶基因为靶基因建立了PCR快速检测方法。实验证明该方法具有良好的特异性与敏感性,对维氏气单胞菌基因组DNA的最低检测浓度为1.58×10-4ng;在人工模拟试验的30份样品中:使用PCR检测方法的样本检出率达到了86.7%(26/30),高于细菌分离培养的检出率73.3%(22/30)。该方法的建立为维氏气单胞菌的快速检测提供了新的方法。     

鱼源嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌PCR-RFLP鉴别方法的建立

嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌是鱼类常见条件致病菌,采用传统的形态分类和生理生化反应进行鉴别费时费力,有时还会错误判断,为了提高鉴别效率和准确率,有必要建立一种快速鉴别两种细菌的分子生物学方法。选取12株鱼源致病气单胞菌使用细菌16SrDNA通用引物扩增细菌目的片段,将所测得序列校正后构建系统发育树以明确菌种,并依据种间序列差异筛选合适的限制性核酸内切酶,对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌进行PCR-RFLP酶切图谱的鉴别分析。筛选出嗜水气单胞菌16SrDNA的特异性限制性核酸内切酶SnaBⅠ和可以鉴别维氏气单胞菌的限制性核酸内切酶BseNⅠ,建立了一种快速鉴别嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的PCR-RFLP方法。研究结果对于淡水养殖鱼类嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌细菌性病害的病原快速鉴别具有参考和应用价值。     

乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的生物学活性分析

为研究维氏气单胞菌胞外产物在乌鳢感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理,以乌鳢源维氏气单胞菌WL161为研究对象,提取其胞外产物,采用打孔法测定其胞外产物的酶活性,并对与毒力密切相关的溶血活性进行进一步的溶血谱研究,同时分析其致病性。应用LCMSMS方法对其胞外产物蛋白成分进行鉴定,利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明,WL161菌株具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性,不具有明胶酶活性;ECP对其他多种动物红细胞均有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡红细胞无溶血活性。其胞外产物共检测出118种蛋白,共参与40种生物学过程,主要涉及碳水化合物代谢过程、几丁质分解代谢过程、DNA结合等;69种分子功能主要涉及ATP结合、金属离子结合、碳水化合物结合等;19种细胞组分主要包括胞外区、细胞质、细胞外膜等。     

青虾源维氏气单胞菌胞外产物生物学特性及蛋白成分分析

为了研究维氏气单胞菌胞外产物在青虾感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理,本试验以青虾源维氏气单胞菌QXF0711B为研究对象,提取其胞外产物,采用打孔法测定其胞外产物的酶活性,并对溶血活性进行溶血谱分析,同时分析其致病性。应用液相质谱与串联质谱相结合方法(LC-MSMS)对其胞外产物蛋白成分进行鉴定,利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明:QXF0711B菌株胞外产物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性,不具有明胶酶活性;其可溶解多种动物红细胞,尤以对鱼类红细胞溶血性更强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。通过对菌株胞外产物蛋白成分分析显示有90种蛋白:共参与45种生物学过程,主要涉及碳水化合物代谢过程、运输等;共有46种分子功能,主要涉及DNA结合、ATP结合、金属离子结合等;为12种细胞组分,主要包括膜的有机组成、细胞质、细胞外膜等。     

丁鲑鱼维氏气单胞菌的鉴定和生物学特性研究

对引起丁鲑鱼发病的菌株——XN602进行鉴定和生物学特性研究,经形态特征与生理生化鉴定,结果表明:该菌为革兰氏阴性杆菌,其16SrDNA序列与GenBank中多株维氏气单胞菌相似性高达99%,系统发育树显示该菌与维氏气单胞菌聚为一簇。因此,分离菌株XN602在分类学上应属于维氏气单胞菌。     

温和气单胞菌毒力基因的检测及其对鲫鱼致病性试验

为探究温和气单胞菌菌株A.S1的致病性,采用PCR方法扩增溶血素基因(hly)、细胞兴奋性肠毒素基因(alt)、黏附素基因(aha1)和气溶素基因(aerA)4种毒力基因,并运用动物回归试验探究菌株A.S1对鲫鱼的致病性。结果表明,菌株A.S1可扩增出hly、aha1和alt 3种毒力基因,未扩增出aerA基因。动物回归试验显示,试验组鲫鱼在腹腔注射温和气单胞菌0.3mL(浓度为1.5×108 CFU/mL)后,5d内死亡率达100%。表明毒力基因型为hly+、aha1+、alt+和aerA-的菌株A.S1为高毒力菌株,且菌株的毒力基因型与致病性呈正相关。     

林蛙源嗜水气单胞菌β-溶血素基因序列分析

对林蛙源嗜水气单胞菌β-溶血素基因与AHL316HEM进行序列和结构分析表明,目的基因读码框架全长为1482bp,编码长度为493个氨基酸的蛋白,分子量为54.2kD,从起始位点至第23个氨基酸残基形成明显疏水区,可能构成信号肽。同源性分析表明,AHL316HEM基因编码的氨基酸序列与林蛙源嗜水气单胞菌溶血素基因的同源率为99.7%,表明俩者可能有共同的起源。     

中草药对罗非鱼源维氏气单胞菌体外抑菌效果研究

为了探求和补充对维氏气单胞菌引起的水产动物病害防治有效的中草药种类,本试验以从罗非鱼体内分离得到并通过生化鉴定初步确定的维氏气单胞菌作为研究对象,选取27种中草药进行初筛,测定各中草药的抑菌圈直径,对中度敏感且尚无关于维氏气单胞菌抑菌情况报道的几种中草药进行最小抑菌浓度(MIC)试验。结果表明:有14种中草药对维氏气单胞菌有抑菌效果,但抑菌活性差别较大。其中五味子对维氏气单胞菌的抑菌效果为高度敏感,苦楝树皮、山楂、大黄、公丁香、鸡血藤、丹参、决明子、藿香、牡丹皮和生地对维氏气单胞菌的抑菌效果为中度敏感,仙鹤草、没药和玄参等对维氏气单胞菌的抑菌效果为低度敏感。鸡血藤、苦谏树皮和丹参的MIC值最低,均为31.25 mg/mL;山楂为250 mg/mL;而决明子的MIC值最高,为500 mg/mL。说明五味子、鸡血藤、苦谏树皮和丹参这4种中草药对罗非鱼维氏气单胞菌的抑菌效果较好。     

库拉索芦荟提取物对两种气单胞菌的抑菌作用

为探究库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的抑菌作用,采用醇提法提取库拉索芦荟得到芦荟提取物,使用二倍稀释法和K-B法测定库拉索芦荟提取物对两种气单胞菌的抑菌作用,再用嗜水气单胞菌回感鲫鱼,并用库拉索芦荟提取物对患病鲫鱼进行治疗。结果显示:库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为95 mg/mL,最小灭菌浓度(MBC)为105 mg/mL;对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为62 mg/mL,最小灭菌浓度(MBC)为65 mg/mL。库拉索芦荟提取物对维氏气单胞菌的抑菌效力与强力霉素、红霉素、奥复星相当,抑菌环直径均为16 mm。嗜水气单胞菌攻毒试验中,对照组鲫鱼死亡率高达100%,而库拉索芦荟治疗组的鲫鱼死亡率降低至20%。库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌与维氏气单胞菌有良好的抑菌效果。     

维氏气单胞菌的分离鉴定及系统进化分析

维氏气单胞菌亦被称为维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌,该菌为近些年来发现和鉴定的一个气单胞菌新种。已知气单胞菌普遍存在于淡水、海水、淤泥和污水等环境中,世界各地均有     

1株草龟维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏谱分析

旨在确定河北昌黎县某花鸟鱼店宠物草龟发病死亡的病因,笔者从发病草龟体内分离纯化出1株优势菌CLW-1,通过解剖观察、细菌分离培养、革兰染色镜检、生化鉴定和16S rDNA基因测序对其分析鉴定,并通过药物敏感性测试检测菌株的耐药性,通过斑马鱼接种试验和毒力基因检测其致病性。结果显示,该菌在血琼脂平板形成湿润、表面光滑、呈β溶血的灰白色菌落,在RS琼脂培养基上长出光滑湿润的黄色菌落;革兰染色镜检为阴性短小球杆菌;16S rDNA基因序列同源性分析表明,分离菌株CLW-1与维氏气单胞菌为同一族,相似性均达99%以上;斑马鱼接种试验结果显示,该菌具有较高的致病力,其LD₅₀为1.26×10⁶CFU;毒力基因扩增结果表明,分离菌株CLW-1具有aerA、Exu、Lip和Ser毒力基因;药敏试验结果显示,分离菌株CLW-1对哌拉西林、头孢唑林和恩诺沙星等敏感;对呋喃唑酮、苯唑西林和红霉素等中敏;对麦迪霉素、克林霉素和万古霉素等耐药。通过试验结果确定此分离菌株CLW-1为维氏气单胞菌,携带毒力基因,具有较高致病力,应用对应的抗生素治疗效果较好,为维氏气单胞菌病的防治奠定基础。