禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。     

不同浓度格利特消毒剂对鸡粪中H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果观察

为验证在有机物存在下格利特(20％戊二醛溶液)消毒剂杀灭禽流感病毒的能力,试验模拟空栏鸡舍和周围环境消毒实际情况,在鸡粪中混入H9亚型禽流感病毒,以接种鸡胚尿囊液中H9亚型禽流感病毒血凝价＜2 log2判为感染阴性,以样品经消毒剂作用后检测不到病毒含量(即0EID50)为病毒完全杀灭(100％杀灭病毒),研究格利特消毒剂杀灭禽流感病毒的效果,结果显示:1∶400以下稀释的格利特消毒剂4℃或25℃作用20 min,均能100％杀灭混入鸡粪中的H9N2禽流感病毒;1∶200稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,能100％杀灭存在于鸡粪和清洁剂中的H9N2禽流感病毒.1∶1600以下稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,均能100％杀灭无鸡粪保护的H9N2禽流感病毒.     

规模化商品肉鸡主要疫病流行动态

1 禽流感 禽流感在很长时间仍然是养禽业重大传染病,是禽病防控的重点.H5亚型家禽禽流感:H5N1、H5N2、H5N6、H5N8;H9亚型家禽禽流感:H9N2;H7亚型家禽禽流感:H7N7、H7N9. 1.1 病毒理化性质 禽流感病毒是囊膜病毒,对去污剂等脂溶剂比较敏感.对碘蒸气和碘溶液特别敏感.常用消毒剂能迅速破坏其传染性.病毒可在加热、极端的pH、非等渗和干燥的条件下失活.禽流感病毒可以在自然环境中,特别是凉爽和潮湿的条件存活很长时间.粪便中病毒的传染性在4℃条件下可以保持长达30～50天,20℃时为7天,60℃、20分钟可以灭活病毒.     

用大肠艾希氏菌多价菌苗免疫妊娠母猪预防仔猪黄痢

妊娠母猪于产前21～30天和9～15天分别口服多价灭活菌苗235ml,同时肌肉接种注射用菌苗5ml.所产46头仔猪中的40头经强毒攻击,保护率为97.5%.妊赈母猪于产前9～13天只用注射菌苗进行一次交巢穴位接种,所产21头中的13头经强毒攻击,保护率为90%.未经免疫的对照母猪共产仔12头,经强毒发击,都在8～21小时内发生腹泻或死亡。未经免疫的7头对照母猪共产仔62头,观察自然感染情况,有23头发生腹泻.     

狂犬病—人腺病毒重组疫苗稳定性的研究(摘要)

含有狂犬病病毒糖蛋白基因的人腺病毒5型(rHAd-RGI)对动物具有口服免疫的潜力,通过测定病毒感染性,对这种重组疫苗在室内和室外的稳定性进行了研究,在室内,病毒在含有卵黄的商品稳定剂和一种单纯缓冲盐水(EBSS)中于4℃和室温(24～25℃条件下分别保存.16天以后,两种介质中的病毒滴度在室温下均比在4℃下降更快.但是,当全面考虑这种疫苗的稳定性时,这种滴度下降矩异是微不足道的,因此意义不大.当该重组病毒与狐狸或具鼬粪便混合,或与EBSS混合,放于不锈钢盘中,将盘子置于密闭条件下时(气温24～25℃,相对湿度45～50%),72小时后粪便中     

2017年盐田区禽流感预警监测结果与分析

一、样品采集与检测项目共进行了4次检测样品采集,共采集鸡喉拭子109份分别进行禽流感病毒分离,具体情况见表1。二、检测内容及结果将鸡喉拭子样品做10000xg,4℃,15min离心处理,经0.45μm过滤器过滤除菌,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚,3枚/份,0.1ml/枚,置37℃孵化机孵化。弃24h内死亡的鸡胚,收集并检测24h至72h的鸡胚尿囊液,进行血凝试验(HA),对HA价达2log以上胚液,分别用H5亚型禽流感HI标准血清、H7亚型禽流感HI标准血清、H9亚型禽流感HI标准血清进行血凝抑制试验(HI)。对HA检测阳性样品鸡胚尿囊液进行RNA抽提,经禽流感(H5、H7、H9)特异性引物进行RT-PCR扩增,检测结果具体情况见表2。     

云南省部分活禽零售市场休市前后禽流感病毒动态监测

[目的]监测活禽零售市场休市前后家禽和环境中禽流感病毒的分布和波动状况,评估定期休市干预效果。[方法]在2015年9月28日至11月11日的3轮休市期间,从云南省选取4个有代表性的活禽零售市场,于休市的前1天、休市当日及休市后1天(复市当日)、3天、5天、10天,采集家禽喉气管、咽喉/泄殖腔棉拭子和环境样品,连续进行3轮采样,采用甲型流感病毒通用型RT-PCR方法,检测样品中的病毒核酸,开展禽流感病毒分布动态监测和休市干预效果评估。[结果]不同市场、不同休市轮次的休市干预效果参差不齐;禽流感病毒在鸡鸭混杂销售的市场中呈现持续分布,而在仅有鸡销售的市场中呈间断或零星分布;鸭群样品阳性率高于环境样品和鸡群样品阳性率。[结论]研究结果提示:鸭群对活禽零售市场的禽流感病毒传入、扩散和持续分布发挥着极其重要的作用;活禽零售市场的休市干预效果受多种因素影响,只有科学规范实施休市制度和严格执行监管措施,才能获得良好的休市干预效果。     

新疆乌鲁木齐市某活禽交易市场禽流感流行病学调查

为了解冬季新疆乌鲁木齐市活禽市场交易禽类及市场外环境中禽流感病毒污染情况及其流行规律,对某交易市场内的鸡、鸭、鹅、鸽等活禽,采集85份活禽全血样本和143份棉拭子样本(103份活禽泄殖腔/咽喉棉拭子、40份环境棉拭子),分别采用血清学和实时荧光定量(rRT-PCR)方法,检测禽流感免疫抗体和禽流感病毒核酸,并对核酸阳性样品进行病毒亚型确定。结果显示:85份全血样本中,H5(Re-11)株免疫抗体合格32份,合格率为37.6%;H5(Re-12)株免疫抗体合格34份,合格率为40%;H7(Re-2)株免疫抗体合格46份,合格率为54.2%。143份棉拭子样本中,禽流感病毒核酸阳性36份,阳性率为25.17%。其中:活禽棉拭子阳性29份,阳性率为28.15%;交易区外环境棉拭子阳性7份,阳性率为17.5%。36份禽流感病毒核酸阳性样本中,H5亚型3份,阳性率为8.33%;H9亚型22份,阳性率为61.11%;未定型11份,阳性率为30.56%。结果表明:该市场交易活禽流感病毒感染率较高,且强制免疫的H5、H7亚型禽流感免疫抗体合格率较低,存在疫情发生和散播风险。结果提示,应加强活禽交易市场的消毒与管理,降低禽流感病毒通过活禽交易市场传播的风险。     

禽流感潜伏期最长可达21d

据全国防治高致病性禽流感指挥部办公室 禽流感病毒存在于病禽和感染禽的消化　　介绍,高致病性禽流感的潜伏期从数小时到数道、呼吸道和禽体脏器组织中。因此,病毒可　天,最长时间可达21d。 随眼、鼻、口腔分泌物及粪便排出体外,含禽　　潜伏期的长短受多种因素的影响,如病毒 病毒的分泌物、粪便、死禽尸体污染的任何物　的毒力、感染的数量、禽体的抵抗力、日龄大小体,如饲料、饮水、鸡舍、空气、笼具、饲养管理　　和品种、饲养管理情况、营养状况、环境卫生及用具,运输车辆、昆虫以及各种携带病毒的鸟　是否有应激条件的影响…     

反复冻融次数和不同保存温度对病毒滴度的影响

为探讨在有宿主细胞的情况下,反复冻融和不同保存温度对病毒滴度的影响,将收集的含ST细胞培养的猪细小病毒和含Vero细胞培养的伪狂犬病病毒经过不同次数的反复冻融,测定其病毒滴度。将收集的猪细小病毒液和伪狂犬病病毒液分别在4、22、-20、-80℃保存,间隔一段时间后测定半数组织细胞感染剂量(TCID_(50)),以了解病毒滴度。结果显示,含ST细胞的猪细小病毒和含Vero细胞的伪狂犬病病毒经过反复冻融3次之后,病毒滴度比未经冻融的病毒滴度分别提高了1.81lg和1.86lg。同一温度下,随着放置时间的增加,病毒滴度均呈下降的趋势。在一定时间内,不同保存温度下病毒滴度有明显区别,但在-20℃和-80℃条件下保存的病毒滴度下降比4℃和22℃条件下保存的慢。因此,在培养病毒的时候可以用反复冻融3次的方法来提高病毒的滴度。4℃和22℃只能作为病毒的短期储存温度,-20℃和-80℃对于病毒来说是合适的保存温度。     

湖北荆州部分地区家鸭毛毕吸虫病调查

为了解湖北荆州太湖港水域家鸭毛毕吸虫病流行现状,用血清学诊断法、顶管毛蚴孵化法、饱和食盐水漂浮虫卵法等检测了家鸭毛毕吸虫感染情况。结果显示,血清学检查阳性率为5.26%,饱和食盐水漂浮虫卵法检查阳性率为5.48%,粪便毛蚴孵化法检查阳性率为6.84%。结果提示,该地区存在家鸭毛毕吸虫病。     

A longitudinal study of a novel dot-enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian influenza virus

A monoclonal antibody (MAb)-based dot-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been developed that detected the epitopes specifically associated with avian influenza virus (AIV). The dot-ELISA detected the antigens of AIV directly from clinical and field specimens. Data obtained from experimentally AIV-infected specific-pathogen-free chickens and also the 2001/02 AIV outbreak of serotype H7N2 positive flocks in Pennsylvania indicated that the mean sensitivity (Se) of the dot-ELISA ranged between 45% and 68% and the mean specificity (Sp), between 85% and 90%. The values were derived from various clinical and field specimens when compared with virus isolation with embryonating chicken eggs. On routine AIV surveillance samples, the dot-ELISA achieved a 92%-100% Sp on the basis of resting over 1500 AIV surveillance samples that were confirmed negative by virus isolation. The dot-ELISA detected AIV antigens with a 5-microl allantoic fluid sample that contained a concentration of 0.4 hemagglutinating units. Furthermore, the dot-ELISA retained its specificity for AIV because no cross-reactions were obtained with various other avian viruses. The findings in this study indicated that the dot-ELISA was highly sensitive and specific and comparable with the commercial Directigen test in the detection of AIV obtained from clinical and field specimens.     

Investigation of H7N2 avian influenza outbreaks in two broiler breeder flocks in Pennsylvania, 2001-02

An avian influenza (AI) outbreak occurred in meat-type chickens in central Pennsylvania from December 2001 to January 2002. Two broiler breeder flocks were initially infected almost simultaneously in early December. Avian influenza virus (AIV), H7N2 subtype, was isolated from the two premises in our laboratory. The H7N2 isolates were characterized as a low pathogenic strain at the National Veterinary Services Laboratories based on molecular sequencing of the virus hemagglutinin cleavage site and virus challenge studies in specific-pathogen-free leghorn chickens. However, clinical observations and pathologic findings indicated that this H7N2 virus appeared to be significantly pathogenic in meat-type chickens under field conditions. Follow-up investigation indicated that this H7N2 virus spread rapidly within each flock. Within 7 days of the recognized start of the outbreak, over 90% seroconversion was observed in the birds by the hemagglutination inhibition test. A diagnosis of AI was made within 24 hr of bird submission during this outbreak using a combination of virus detection by a same-day dot-enzyme-linked immunosorbent assay and virus isolation in embryonating chicken eggs. Follow-up investigation revealed that heavy virus shedding (90%-100% of birds shedding AIV) occurred between 4 and 7 days after disease onset, and a few birds (15%) continued to shed virus at 13 days post-disease onset, as detected by virus isolation on tracheal and cloacal swabs. AIV was not detected in or on eggs laid by the breeders during the testing phase of the outbreak. The two flocks were depopulated at 14 days after disease onset, and AIV was not detected on the two premises 23 days after depopulation.     

中国鸭源H5N6 AIV血凝素和神经氨酸酶基因特征及遗传进化分析

为明确中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因特征及其遗传变异情况,研究选取了NCBI流感病毒资源库里的32株具有完整ORF编码区的中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因序列,利用分子生物学软件分析其HA和NA基因特征及其遗传进化情况。结果显示,中国鸭源H5N6 AIV的HA裂解位点有REKRRKR↓G、RERRRKR↓G和KEKRRKR↓G三种类型,HA有6个潜在的N-糖基化位点,其中第182、222、224位氨基酸依次为N、Q、G,具有与禽源唾液酸α-2,3受体结合的特性,然而HA发生了S123P/T、T156A、S223R氨基酸位点突变,部分毒株发生了I151T氨基酸位点突变;HA基因核苷酸遗传进化分析显示,中国鸭源H5N6 AIV遗传进化上均处于clade2.3.4.4分支,并进一步进化出Ⅰ和Ⅱ两个亚分支。部分中国鸭源H5N6 AIV NA第59~69位缺失11个氨基酸,中国鸭源H5N6 AIV NA基因遗传进化上分为两个大的分支,分别对应NA基因颈部缺失型和完整型两种类型;NA颈部完整型的NA有6个潜在的N-糖基化位点,NA颈部缺失型的NA由于第59~69位氨基酸的缺失,导致其第67位丢失了一个N-糖基化位点。研究为中国鸭源H5N6 AIV的生物学特性和遗传进化特征研究奠定基础。     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp（DHV）、264bp（AIV）和362bp（NDV）,且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。     

荧光RT-PCR技术与古典病原分离技术检测AIV比较试验

应用荧光RT-PCR技术和古典病原分离技术对304份样品进行AIV对比检测试验，结果应用RT-PCR技术可在4小时内从304份样品中检出AIV阳性26份，而病原分离技术检出了AIV阳性22份，需要时间为至少15天．两者阳性样品重复率为100％，因此，与古典病原分离技术比较，荧光RT-PCR技术具有高度特异、敏感的特性，而且可以大大地缩短对AIV的检测时间。     

H5NI型禽流感病毒纳米量子点快速检测方法的建立

本文介绍了一种用CdSe量子点标记技术用于H5NI型禽流感病毒检测的方法。采用CdSe量子点标记鸡抗AIVIgG,并对标记的抗体量子点复合产物进行了纯化。H5N1型禽流感病毒单克隆抗体作为包被抗体,CdSe量子点标记的鸡抗AIVIgG作为检测抗体,建立了纳米量子点应用于禽流感病毒快速检测的方法。此方法的最佳检测组织为气管和肺,整个检测过程只需3小时。实验结果表明,对已知的阳性样品其敏感性比血凝试验要高出4倍以上,与新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒等无交叉反应。对65份病料进行检测,结果有5份阳性病例,60份阴性病例,与鸡胚分离法作为比对,结果符合率为98.46%,说明此方法具有较好的特异性和灵敏度,该方法操作简单、检测快速快,在进出口检疫方面有良好的应用前景。     

1株野鸭源H6N2亚型AIV对SPF鸭的致病性

本研究选取2周龄SPF鸭（绍兴麻鸭）自天然孔感染1株野鸭源H6N2亚型LPAIV,评价其对幼龄鸭的致病性。结果显示,试验感染鸭临床症状较轻微,病毒在鸭消化道复制能力较呼吸道内更强,且具有水平传播的能力。仅能在盲肠扁桃体和法氏囊2个组织器官中检测到病毒,但可对法氏囊等多个组织器官造成不同程度的损伤。此外感染鸭可产生HI抗体,并在第21天达到高峰。结果表明,该株H6N2亚型LPAIV对幼龄鸭的致病力较低,在AIV病毒传播中幼龄鸭起到了一定作用,为研究H6N2亚型LPAIV的致病机制及AIV发病机理提供了理论数据。     

间接ELISA,HI及AGP检测鸡血清中抗AIV抗体的敏感性比较

用鸭源Ａ型流感病毒Ｈ９Ｎ？滴鼻、点眼辅以腹腔注射,人工感染３周龄ＳＰＦ来航鸡,分别用ＡＧＰ、ＨＩ试验及间接ＥＬＩＳＡ定期测定其抗ＡＩＶ血清效价。结果,ＨＩ试验及间接ＥＬＩＳＡ于攻毒后第７～７９天显示阳性;ＡＧＰ试验从第１３～７９天呈阳性。根据首次检出血清中抗ＡＩＶ抗体的时间,间接ＥＬＩＳＡ比ＡＧＰ、ＨＩ更灵敏、快速。