猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂的研究

为了解耐热冻干保护剂在猪繁殖与呼吸综合征活疫苗中的应用效果,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)分别与耐热冻干保护剂和常规冻干保护剂进行配比、冻干,制备疫苗,分别将疫苗置2~8℃保存,定期测定其效价,同时进行37℃、25℃耐老化试验。结果显示,疫苗在2~8℃条件下保存24个月,耐热苗效价下降不超过0.5个滴度,常规苗效价下降超过3.0个滴度;37℃保存10d,耐热苗效价下降不超过0.5个滴度,常规疫苗下降超过2个滴度;25℃常温保存2个月,耐热保护剂疫苗效价下降不超过0.35个滴度,而常规苗效价下降超过2个滴度。试验结果表明,耐热冻干保护剂对病毒的保护效果明显优于常规冻干保护剂,具有良好的热稳定性。     

冻干活疫苗耐老化试验与保存期的相关性研究

将鸡痘活疫苗、鸡传染性支气管炎(H52)活疫苗和鸡新城疫(LaSota)活疫苗分别置于37℃和2~8℃条件下储存,在不同时间段检测其病毒滴度,发现鸡痘活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗和新城疫活疫苗在37℃条件下放置10d,病毒含量滴度分别为0.38、0.42和0.73,分别等同于2~8℃下放置24个月、21个月和24个月下降的病毒滴度程度。     

羊传染性脓疱皮炎弱毒苗耐热保护剂初步优化筛选试验研究

试验以羊传染性脓疱皮炎弱毒活疫苗为对象,依据冻干保护剂的保护功能,对耐热保护剂的组成、混合比例进行了初步筛选。通过反复试验,对其物理性状观察、水分含量测定、冻干前后病毒损失量、经37℃处理、25℃保存后病毒损失量等指标的比较进行筛选,优选出了符合要求的A3、A6、C4三个耐热保护剂配方。试验结果表明,使用保护剂的羊口疮疫苗在37℃保存20 d,病毒含量下降0.5~0.7个滴度,常规疫苗下降2.3个滴度;25℃保存60d,病毒含量下降0.3~0.6个滴度,常规疫苗下降2.5个滴度。从而证明了羊orf耐热活疫苗耐热效果优于常规疫苗。     

鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗耐热保护剂筛选和优化

应用冻干制品加速热稳定试验,测试7组冻干保护剂配方对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（LaSota株＋H120株）的耐热保护效果。试验筛选出用于鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗的耐热保护剂,使用该保护剂的疫苗表现为37℃保存10d,病毒含量下降0．4个滴度,常规疫苗下降2～2．4个滴度;25℃保存30d,病毒含量下降0．4～0．6个滴度,常规疫苗下降1．8～2．6个滴度。证明此保护剂具有良好的耐热效果。     

鸡传染性支气管炎耐热活疫苗的研究

应用鸡传染性支气管炎病毒(H52株)与不同耐热保护剂配方和冻干曲线进行筛选.结果表明:采用冻干曲线2和耐热保护剂WXS冻干鸡传染性支气管炎病毒H52弱毒疫苗效果最佳.试制耐热活疫苗3批,其各项检验均符合要求.耐老化试验表明:经过37℃放置10d的每羽份病毒含量下降0.6～0.8个滴度,每羽份病毒含量达104.7～105.1EID50.保存期试验表明:2～8℃保存24个月疫苗每羽份病毒含量下降0.4～0.6个滴度,每羽份病毒达104.1～104.3EID50.疫苗2～8 ℃保存24个月后效检抗体水平达到1:16～1:32.免疫持续期试验表明:免疫21日龄SPF鸡,6个月后血清中和抗体效价达到1:32～1:64.田间试验表明临床观察无不良反应,安全有效.特异性试验表明耐热活疫苗抗原性不变.耐热保护剂生物学和理化特性表明保护剂安全、稳定,室温保存期达3个月.     

水貂犬瘟热Vero细胞活疫苗(CDV_3-CL株，悬浮培养)保存期试验

为了探讨不同保存条件和保存期对新研制犬瘟热疫苗病毒滴度和免疫效力的影响,将3批疫苗分别置于2～8℃和-20℃保存,并随机取样进行质量、安全和免疫效力检验。结果表明:疫苗在2～8℃条件下保存6个月TCID_(50)没有明显变化,9～12个月内下降0.3～0.5滴度;-20℃保存12个月没有显著变化,15个月内下降0.1滴度左右;疫苗能诱导产生高免疫保护水平的抗体,确定疫苗保存期2～8℃和-20℃分别为6个月和12个月;保存期内的疫苗的物理性状、无菌、支原体、外源病毒等检验均符合《中国兽药典》的要求。     

猪口腔液中伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸稳定性研究

猪口腔液作为一种生物检材,在猪群疫病监测和诊断中受到越来越广泛的应用。目前尚不清楚病毒核酸在口腔液中的稳定性。利用猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,采用荧光定量PCR技术,评估核酸保护剂和保存温度对病毒核酸在口腔液中稳定性的影响。结果显示,在4℃或室温条件保存1 d后,核酸保护剂组病毒核酸含量比对照组分别高10倍或100倍左右,二者差异显著(P0.05或P0.01);当使用核酸保护剂时,在4℃或室温条件保存1 d～3 d,病毒核酸含量依然保持稳定,二者差异不显著;而当不使用核酸保护剂,保存1 d后,4℃条件下病毒核酸含量比室温条件下高10倍左右。使用不同公司的核酸提取产品提取含有核酸保护剂的样品,在核酸提取效率上无显著差异,说明核酸保护剂对后续核酸提取产品具有很好的兼容性。表明核酸保护剂和低温在防止口腔液中病毒核酸降解方面效果显著,研究结果为临床猪口腔液作为生物检材的科学使用提供了参考。     

生物缓冲剂HEPES对促进口蹄疫抗原稳定性的研究

口蹄疫抗原在储存和疫苗制备过程中容易降解,影响疫苗效果。口蹄疫抗原的降解速度与维持液的pH值的稳定性有关,制备出pH稳定性强的维持液可提高口蹄疫疫苗质量。对生物缓冲剂HEPES进行研究,分别用含有和不含有HEPES的MEM维持液在BHK细胞上培养病毒,将病毒放在37℃温箱内,分别在0、24、48、72h取样,通过微量细胞中和试验检测病毒效价,并进行比较。结果表明,在37℃条件下,不含生物缓冲剂的病毒液TCID50下降幅度比含生物缓冲剂的病毒液大,72h时,前者毒价为零,后者TCID50为10-2.5。由此可知,HEPES可以有效地改善病毒培养液缓冲能力,促进病毒颗粒的稳定性。     

猪繁殖与呼吸综合征糖玻璃活疫苗制备及其耐热性能的初步研究

采用蔗糖、胰蛋白胨等成分配伍的耐热保护剂处方T28C-5,对猪繁殖与呼吸终审合征病毒(PRRSV)进行了真空梯度干燥,获得性状为干燥致密的白色泡沫状疫苗。采用扫描电镜对PRRS泡沫疫苗和传统的冻干商品疫苗进行了形貌分析,发现泡沫疫苗呈现糖玻璃样,而冻干疫苗呈现疏松孔道样。DSC测定结果表明,泡沫疫苗具有较高的Tg,为57.45℃。干燥的疫苗在37℃保存4个月,病毒效价损失≤1.0 Lg;25℃保存5个月,病毒滴度损失仍0.8 Lg;自然环境温度下保存190 d(历尽夏季、秋季、冬季),病毒滴度损失仍0.6 Lg。将37℃、25℃及4℃下保存3个月的泡沫干燥疫苗免疫20日龄仔猪,免后2周ELISA抗体水平合格且与商品苗趋势相当。试验结果表明泡沫干燥疫苗具有卓越的耐热性能。     

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应

作者应用含CpG基序序列的重组质粒(即CpG DNA)作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果.结果表明:CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍.CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照;与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照(PD50> 4.69).在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗(50、200μg·头份-1)都比高剂量组(500 μg·头份-1)诱导的抗体滴度高,其中50和200μg·头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14～32 d诱导的抗体滴度高达1:1 500,是标准疫苗的4～5倍,而500μg·头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应.研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔.     

反复冻融次数和不同保存温度对病毒滴度的影响

为探讨在有宿主细胞的情况下,反复冻融和不同保存温度对病毒滴度的影响,将收集的含ST细胞培养的猪细小病毒和含Vero细胞培养的伪狂犬病病毒经过不同次数的反复冻融,测定其病毒滴度。将收集的猪细小病毒液和伪狂犬病病毒液分别在4、22、-20、-80℃保存,间隔一段时间后测定半数组织细胞感染剂量(TCID_(50)),以了解病毒滴度。结果显示,含ST细胞的猪细小病毒和含Vero细胞的伪狂犬病病毒经过反复冻融3次之后,病毒滴度比未经冻融的病毒滴度分别提高了1.81lg和1.86lg。同一温度下,随着放置时间的增加,病毒滴度均呈下降的趋势。在一定时间内,不同保存温度下病毒滴度有明显区别,但在-20℃和-80℃条件下保存的病毒滴度下降比4℃和22℃条件下保存的慢。因此,在培养病毒的时候可以用反复冻融3次的方法来提高病毒的滴度。4℃和22℃只能作为病毒的短期储存温度,-20℃和-80℃对于病毒来说是合适的保存温度。     

测定鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）参考品有效期的经典热加速稳定试验

采用热加速稳定性试验,以鸡胚半数致死量测定法对制备的参考疫苗进行病毒含量测定,预期其贮存有效期。根据Arrhenius方程,以不同温度下衰减速率常数K估算较低温度下K值,并计算参考疫苗在-30℃下贮存效力值下降一个滴度所需的时间约为2．4年。     

羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂筛选及冻干曲线优化

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方,再通过Plackett-Burman设计法筛选主要保护剂基质,然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒(ORFV)耐热保护剂配方进一步优化,用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的耐热冻干保护剂作为疫苗用候选配方。同时,依据前期试验获得的活疫苗冻干曲线,通过进一步优化,获得疫苗最佳冻干曲线。利用该冻干工艺冻干的疫苗,保护剂的保护率可达95.3%,且疫苗各项指标均达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》要求。经37℃保存7,15,30d病毒滴度分别下降0.46,0.70,1.00;2~8℃保存3,6,12,24个月病毒滴度分别下降0.10,0.10,0.40,0.60,证明此配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。本试验解决了ORFV细胞弱毒疫苗仅能在低温条件下保存和运输的瓶颈技术问题,使疫苗的储存、运输更为方便。     

表达绿色荧光蛋白的重组人偏肺病毒的构建及其中和抗体检测方法的应用

人偏肺病毒(hMPV)是最新发现的与呼吸道疾病有关的病原体.为构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的B型重组hMPV,本研究利用反向遗传学技术,以表达EGFP的hMPV NL/1/99株全长cDNA质粒重组pPS-hMPV-EGFP,及其4种辅助重组质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-L、pCITE-M2.1为基础,共转染BHK-21细胞进行重组病毒的拯救.鉴定结果表明拯救的重组病毒rhMPV-NL-EGFP高效表达外源基因EGFP.rhMPV-NL-EGFP与亲本病毒株具有相似的生物学特性,生长滴度可达106.7 TCID50/mL.rhMPV-NL-EGFP在细胞中连续传代10代仍然维持外源基因的高效和稳定表达,病毒滴度于室温条件下可维持长时间稳定.分别利用亲本病毒株和重组病毒rhMPV-NL-EGFP进行免疫小鼠血清中和抗体检测,结果显示两种方法具有较好的相似性(p＞0.05).本研究为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法,同时为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础.     

鸡毒支原体活疫苗的保存期测定

将鸡毒支原体弱毒冻干疫苗和湿苗分别在不同温度下保存,然后分别在不同时间内测定其活菌数和鸡体内免疫效力测定。活菌数测定结果表明：鸡毒支原体冻干疫苗在－２５℃的条件下保存１１．５个月,活菌数维持不变;在－１５℃保存９．５个月,活菌数下降一个滴度;在４℃～１０℃条件下保存８．５个月,活菌数不变。湿苗（培养物）的室温２４℃保存４ｄ,活苗数不变,保存５ｄ活菌数下降两个滴度;在３２℃保存４８ｈ活菌数不变,保存     

羊传染性脓疱皮炎弱毒苗耐热保护剂的筛选优化

旨在筛选出羊传染性脓疱皮炎弱毒苗的最佳耐热保护剂。通过初步筛选,选出符合本试验设计要求的3组保护剂A3、A6、C4,以羊传染性脓疱皮炎弱毒为对象,以保存环境、保存期长短、病毒损失量为参数,采用单因子试验对3组耐热保护剂进行优化,优选出对羊传染性脓疱皮炎弱毒苗耐热保护效果最好、且经济实用的耐热保护剂A6组。试验结果显示,使用A6保护剂的羊传染性脓疱皮炎疫苗在37℃保存3周,病毒含量下降0.4个滴度,常规疫苗下降2.4个滴度;25℃保存60 d,病毒含量下降0.3个滴度,常规疫苗下降2.2个滴度;4℃保存9个月,病毒含量下降0.4个滴度,常规疫苗下降3.8个滴度,说明A6可作为羊传染性脓疱皮炎弱毒苗良好的耐热保护剂。     

鸡毒支原体活苗的保存期测定

将鸡毒支原体弱毒冻干疫苗和湿苗分别在不同温度下保存，然后分别在不同时间内测定其活菌数和鸡体免疫效力。活菌数测定结果表明：鸡毒支原体冻干疫苗在－２５℃的条件下保存１１．５个月，活菌数保持不变；在－１５℃保存９．５个月，活菌数下降一个滴度；在４℃－１０℃条件下保存８．５个月，活菌数不变。湿苗（培养物）的室温２４℃保存４ｄ，活苗数不变，保存５ｄ活菌数下降两个滴度；在３２℃保存４８ｈ活菌数不变，保存８０ｈ下降４个滴度；在４℃－７℃条件下保存３ｄ活菌数不变，保存４－９ｄ下降一个滴度；湿苗在－２５℃保存１个…     

O型口蹄疫多基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内.含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌.利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC).在Lipofectamine2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC).半数组织培养感染剂量(TCID_(50))测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为10~(5.5) TCID_(50)/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础.     

H9N2亚型禽流感病毒细胞灭活疫苗的免疫效果评价

由于经济和技术因素的制约,尚未有成功的禽流感细胞疫苗产品上市.为此,本研究在细胞扩增而来的含有H9亚型禽流感病毒(AIV)HA和NA基因的SH441HANAPR8(NS mutant)重组病毒里加入终浓度为0.1％的甲醛进行灭活.结果显示,37℃条件下灭活24 h的效果最佳.灭活好的H9 AIV SH441HANAPR8(NS mutant)与佐剂Montanide ISA 70VG乳化制备成灭活苗,以0.05、0.1、0.2、0.3 mL/只的剂量,分别胸部肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡,并于免疫后21d静脉感染A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2) AIV.结果显示,该疫苗的最小免疫剂量为0.2 mL.此外,研究还发现,当HI抗体效价≥25时,疫苗对鸡只的攻毒保护率达到100％.     

以伪狂犬病病毒(Bartha-K61)为载体正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白重组疫苗的构建

构建以伪狂犬病病毒Bartha-K61株为载体的正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白的重组活载体疫苗.将eGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Mlu Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8AA-eGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/eGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的滴度(TCID_(50))为10~(8.125)/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组Bartha-K61的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制与开发奠定基础.