猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析

根据 GenBank 中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV- 2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出 ORF2 基因(702 bp)。将此基因片段克隆入 pMD -18 T载体,筛选获得重组质粒 pMD ORF2 并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与德国分离株AF201897核苷酸序列同源性为99.5%与其它PCV- 2 的 ORF2 核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。     

2株猪圆环病毒2型ORF2的克隆及序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核酸序列,设计一对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得重组质粒pMD18T-ORF2。序列分析表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2ORF2的分离株的同源性在91.5%～99.4%,与杭州分离株的同源性达到99.4%,表明我国各地区之间PCV-2的分离株存在较大的差异。     

2株猪圆环病毒ORF2基因的克隆测序

对分离到的2株猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了2个毒株的ORF2基因阳性克隆。序列分析表明,这2个分离株与其他中国分离株同源性高达99%以上,同处于一个基因簇,但和中国BF分离株同源性却只有92.3%。而荷兰分离的NL-PMWS-2株与中国分离株的同源性却在99%以上,表明中国流行的PCV-2和国外分离株有密切关系。     

两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间.     

二型圆环病毒ORF2基因的序列分析

通过PCR扩增，对两株分离到的2型猪圆环病毒的ORF2基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与T载体连接，获得了两个毒株的ORF2基因阳性克隆。序列分析表明，与其它中国分离株同源性高达99%，同处于一个基因簇，但和中国BF分离株同源性却只有92.3%。而荷兰分离的NL-PMWS-2株与中国分离株的同源性却在99%以上，表明中国流行的PCV-2和国外分离株有密切关系。     

PCV-2海南株ORF2基因的克隆及序列分析

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)ORF2基因的分子特征,试验采用PCR方法从疑似圆环病毒感染的猪组织病料中扩增ORF2基因(大约730 bp),将纯化后的PCR产物克隆入p MD18-T载体,筛选鉴定后进行序列测定。结果表明:克隆的PCV-2海南株ORF2基因与来自国内的GZ株的核苷酸序列及推导氨基酸序列相似性最高,分别达到99.6%和99.6%;与疫苗株SH的核苷酸序列相似性为98.9%,推导的氨基酸序列相似性为98.7%;而与疫苗株LG的核苷酸序列相似性为91.3%,推导的氨基酸序列相似性为90.6%。     

2012年-2014年黑龙江省部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解黑龙江省近年来猪圆环病毒2型(PCV-2)的流行情况,将2012年-2014年期间采集自黑龙江哈尔滨、七台河、大庆、牡丹江、绥化、伊春、佳木斯等不同地区的疑似PCV-2感染病料共246份进行了PCR检测和病毒分离鉴定,随后对所分离到的11株PCV-2毒株进行ORF2基因的克隆与序列分析。结果表明,在本次采集的样品中,PCV-2阳性病料193份,阳性率为78.46%;各分离毒株之间ORF2基因同源性为90.5%~100%;11株分离病毒中,有6株为PCV-2b基因型,3株为PCV-2a型,2株为PCV-2d型。提示了2012年-2014年间黑龙江省部分地区猪只相继受到PCV-2感染,流行的基因型以PCV-2b为主,各个地区差异不大。     

猪圆环病毒2型江西株的全基因组克隆和序列分析

为了解江西地区猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行和进化情况,根据GenBank上已发表的PCV-2全基因序列设计1对引物,PCR扩增后得到9条PCV-2全基因序列,并对其全基因序列核苷酸和蛋白序列进行分析,绘制遗传进化树。结果表明,江西地区流行的9株PCV-2中,基因组序列全长分为8株1 767 bp和1株1 768 bp,9株PCV-2的核苷酸同源性为94.7%~99.9%,与GenBank己发表的PCV-2分离株全基因组同源性介于94.3%~99.8%之间,而9株PCV-2的ORF1核苷酸序列同源性为96.9%~100.0%。ORF2和ORF3编码的蛋白氨基酸序列存在部分位点突变。遗传进化树显示为3种基因型：5株PCV-2b、3株PCV-2d、1株PCV-2a。本研究有助于江西地区PCV-2的监测和防制。     

猪圆环病毒2型广西株的分离和全基因组序列分析

从广西表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪群中分离到1株猪圆环病毒2型(PCV-2),命名为GXB株.对GXB株的全基因组进行PCR扩增,扩增产物克隆至PMD18-T载体.测序结果表明,全基因组为1 767 bp,与GenBank上已知的8株PCV-2参考株序列的同源性在95.0%～99.6%之间.序列分析表明,GXB株基因组包含11个读码框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的读码框,分别编码314个和233个氨基酸,与其他PCV-2毒株的ORF1、ORF2氨基酸的同源性分别为97.8%～100%、91.5%～98.7%.对GXB株ORF2编码的Cap蛋白基因进行功能分析,表明含有1个潜在的糖基化位点,3个明显的亲水区,有较强的抗原性和亲水性,为作为主要的免疫原性蛋白基因提供了依据.     

猪圆环病毒2型四川分离株ORF2基因的克隆与序列分析

对临床分离毒株PCV-2 sch2010 ORF2基因全序列进行了克隆和序列分析.结果表明,PCV-2sch2010 ORF2全基因共705 bp,编码234个氨基酸,与GenBank发表的21株PCV-2的ORF2参考序列的核苷酸氨基酸序列同源性分别为88.4%～99.7%和87.2%～99.6%;与2株PCV-1 ORF2(GU371908、FJ475129)的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为58.7%～59.5%和62.8%～64.5%;PCV-2 sch2010分离株与PCV-2的欧洲分支群亲缘关系较近.     

猪Ⅱ型圆环病毒广东分离株的全基因组克隆及序列分析

根据GenBank中猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)基因序列,设计两对特异性引物.将PCV-2广东分离株(GD1株)用PK15细胞系培养,从细胞培养物中提取病毒总DNA并以之为模板,用PCR方法分段扩增病毒全基因组,分别克隆到pMD18-T载体,对阳性质粒进行序列测定.用DNAstar对序列进行拼接,得到PCV-2 GD1株基因组全序列,全长为1767个碱基,包涵2个开放阅读杠(ORF1和ORF2),分别编码与复制相关的Rep蛋白和结构蛋白Cap.通过BLAST对所测GD1株核苷核酸序列早国内外已登录GenBank中的PCV-2病毒核苷酸序更进行同源性比较,与PCV-2参考毒株的核苷酸同源性介于94.4%～99.7%之间,与德国株PCV-2(AF201897)的同源性最高,为99.7%;与猪I型圆环病毒(PCV-1)参考株(AY184287)的同源性仅为70%.     

猪圆环病毒2型辽宁分离株ORF2基因的克隆与序列分析

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原.猪圆环病毒2型有11个开放阅读框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的开放阅读框.试验参照国内发表的猪圆环病毒2型分离株的核苷酸序列设计合成了1对引物,对猪圆环病毒2型辽宁株ORF2基因进行PCR扩增、克隆、序列分析,并与GenBank中的猪圆环病毒2型参考毒株ORF2基因进行同源性分析,为进一步建立该病的快速检测方法及分子流行病学研究奠定基础.     

7株猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及其序列分析

为了研究分离的猪圆环病毒2型基因序列,根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计1对引物,通过PCR方法从采自不同地区的7份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PM-WS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV2的ORF2基因,并将获得的ORF2基因片段分别克隆入pMD18-T载体,通过筛选获得重组质粒,分别命名为pMD-PCV2-HN01、pMD-PCV2-DY01、pMD-PCV2-HM01、pMD-PCV2-SDqd01、pMD-PCV2-SDqd02、pMD-PCV2-SDqd03、pMD-PCV2-PD01,并进行测序及序列分析。结果表明:HN01株ORF2基因全长为705 bp,另外6株ORF2基因全长均为702 bp;7株分离株的ORF2基因核苷酸序列同源性较高,为94.0%～99.9%,氨基酸序列同源性达93.6%以上;7株分离株与GenBank中登录的德国株和台湾株的核苷酸序列同源性较低,分别为91.7%～93.2%和89.0%～90.5%,而与丹麦、法国、中国株的核苷酸序列同源性较高,达94.0%以上,氨基酸序列同源性均达89.3%以上。     

猪圆环病毒2型的全基因克隆和序列分析

参考GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)全基因序列,设计一对PCR引物,从病料中扩增获得4株PCV-2的全基因组序列,分别命名为SDNY-PCV-2、ShD-PCV-2、HBbd-PCV-2、GSLN-PCV-2,经测序确定长度均为1 767 bp。应用DNA Star序列分析表明,4个PCV-2分离株与国外部分分离株的核苷酸序列同源性达95.5%~99.8%,与PCV-1毒株的序列同源性为76.2%~77.6%。与国内外部分分离毒株序列进化树分析表明,4个PCV-2分离毒株处于不同分支中,存在一定差异。     

4株猪圆环病毒2型凉山州分离株全基因组进化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)凉山州分离株的基因型,本研究采用PCR方法对采自凉山州3个发病猪场的4个PCV2阳性样品进行全基因组序列的扩增、克隆、测序分析,并绘制遗传进化树。结果显示:4个PCV2凉山州分离株全基因组序列长度均为1767 bp,核苷酸同源性为99.4%~99.8%,与国内外101株PCV2参考毒株核苷酸同源性为93.8%~99.9%,与4个PCV2国产疫苗株核苷酸同源性为95.1%~96.0%;4个分离株ORF1和ORF2基因核苷酸同源性分别为99.3%~99.8%和99.6%~100%;构建的系统进化树显示,4个分离株均为PCV2d亚型,与YA1株(四川雅安,MH094769)的亲缘关系最近。本研究为凉山州PCV2疫苗毒株的选择提供了科学依据。     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。     

猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆和序列分析

根据Genbank已发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)全基因组序列,设计两对特异性引物,建立了PCV-2全基因组的克隆和序列分析方法,并对甘肃省两个规模化养猪场采集的疑似PMWS病料进行了全基因克隆和序列分析,确定了PCV-2毒株基因序列的变异情况。结果表明,PCV-2核苷酸序列稳定,1株标准株与2株分离株全基因序列均由1 768 bp组成,彼此间序列的同源性达94.0%~99.8%,2个分离株之间同源性达94.2%~99.8%;分离株与标准株和Genbank已发表的23株PCV-2毒株参考毒株同源性达92.6%~100%。     

6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析

参考GenBank发表的PCV-2全基因组序列,设计1对引物,通过反向PCR技术扩增出6株PCV-2流行株的全基因,并进行了序列测定分析。结果表明,6个分离株基因组全长为1 768 bp或1 767 bp,同源性比较发现,分离株之间的核苷酸同源性为95.5%~100%,与GenBank上已发表的PCV-2分离株之间的同源性为93.0%~100%,与法国分离株同源性最高。6株分离株的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100%和92.3%~100%,存在较大的变异。     

华东地区PMWS患病猪群PCV-2的检测及其基因特征

用 PCR方法 ,对江苏、上海、山东、江西、安徽和浙江等省市 6 5家猪场 99例断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)肺脏和淋巴结病料 ,进行了猪圆环病毒 - 2 (PCV- 2 )基因检测 ,发现其中 18家猪场 2 1例病料为 PCV- 2阳性。源自安徽和上海的 PCV- 2分离株经基因序列分析显示 ,2个分离株部分 ORF2 与国外分离毒株同源性为 92 %～99%。安徽分离株 AHHF6与韩国分离株 KSY- 1同源性为 99% ,而上海分离株 SHHT1与加拿大分离株 Imp.114 7同源性为 98%。上述结果表明 ,我国 PMWS患病猪群广泛存在 PCV- 2 ,不同地区 PCV- 2存在一定基因差异 ,它们可能来源于不同国家或地区     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。