伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

伪狂犬病病毒Min—A株糖蛋白gE基因真核表达质粒的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）Rice株的gE基因序列设计了1对引物，用PCR法特异性地扩增出了PRV Min-A株的gE基因，并克隆到pUC19中，再与杆状病毒转座质粒pFastBac1连接得到pFastBac-gE，pFastBac-gE转化穿梭载体Bacmid，得到了重组rBacmid-gE表达载体。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在获得重组伪狂犬病病毒（PRV）gE蛋白及其多克隆抗体。利用PCR方法从PRV感染猪的肺脏、脑和扁桃体混合组织中扩增PRV gE基因,连接至克隆载体pMD18-T（pMD-gE）后进行测序与进化树分析。以pMD-gE为模板,利用PCR方法扩增其膜外结构域部分基因（gE-outside）,将其连接至原核表达载体pET-30a（+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-gE-outside。将重组质粒pET-gE-outside转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行表达产物的分析与鉴定。经亲和层析技术纯化重组PRV gE蛋白并免疫小鼠,通过间接ELISA和Western blotting分别进行三免3周血清中鼠抗PRV gE多克隆抗体效价的测定和鉴定。PCR和测序结果表明,本研究成功克隆了PRV gE基因,与国内2011年以后流行毒株属于相同分支。SDS-PAGE和Western blotting结果证实,PRV gE-outside基因在原核表达系统获得正确表达,分子质量约为55 ku,且可与猪抗PRV多克隆抗体发生免疫反应。经亲和层析纯化的gE-outside蛋白浓度为1.23 mg/mL。将其免疫小鼠,三免3周的小鼠血清中鼠抗PRV gE-outside多克隆抗体效价为1：204 800,并可与gE-outside蛋白发生免疫反应。综上,本研究制备了重组PRV gE蛋白和鼠抗PRV gE蛋白多克隆抗体,可为PRV感染机制研究及建立快速、高效免疫学检测技术提供技术指导和材料。     

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRV gE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病(PR)疫苗提供科学依据。     

神经肽S及其受体对伪狂犬病病毒感染的体外作用研究

为了解神经肽S（NPS）及其受体（NPSR）在伪狂犬病病毒（PRV）感染过程中的作用,本试验采用细胞培养、RT-PCR、实时荧光定量PCR及shRNA技术研究NPS和NPSR在PRV体外感染过程中的表达变化,以及NPS和NPSR对病毒基因和相关细胞因子的变化。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示,PRV感染培养的小鼠胚胎成纤维细胞系（3T3细胞）后12和18 h,NPS和NPSR mRNA的表达水平极显著上升（P<0.01）;通过shRNA技术稳定干扰3T3细胞中NPSR表达后,PRV gE基因的表达极显著下调（P<0.01）;添加外源性NPS可显著增强PRV感染的3T3细胞PRV gE基因及细胞因子白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平（P<0.05）;添加NPSR抑制剂后,则极显著抑制细胞中PRV gE基因和细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平（P<0.01）,该作用效果与NPS的作用效果相反。上述结果表明,降低NPSR的表达能有效抑制PRV在3T3细胞上的复制,说明NPSR是PRV有效感染3T3细胞所必需的重要因子;外源性NPS可通过调节炎症细胞因子的表达而加剧PRV感染诱导的炎症反应。本研究结果为深入探索NPS和NPSR在PRV感染动物体内的调节作用奠定了基础。     

猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定

为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC~(PRV-G)。提取BAC~(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC~(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA~(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRV Fa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1.7kb的特异片段,经本科切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经Kpn Ⅰ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经本科切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。     

伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析

在已鉴定了的伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）11种糖蛋白中，gE是其中十分重要的一种非必需糖蛋白，是伪狂犬病病毒重要的毒力基因，它在介导感染细胞的融合，病毒在细胞间的扩散，病毒粒子的释放等方面均起着十分重要的作用，尤其是在影响伪狂犬病病毒神经嗜性和毒力方面的作用。利用PRV gE基因缺失疫苗，结合血清学方法可以区分疫苗接种猪和野毒感染猪。     

检测伪狂犬病病毒的SYBR Green实时荧光定量PCR方法的建立

伪狂犬病病毒（PRV）是严重影响养猪业发展的重要病毒，病毒粒子具有较强的抵抗力。SYBRGreen是结合于双链DNA的荧光染料，可在定量PCR反应时与双链PCR产物结合放出荧光信号，被仪器系统实时监控并检测。目前SYBRGreen荧光定量PCR方法在遗传性疾病的诊断等方面有重要的应用价值。本研究根据编码PRV最保守的基因之一的gB基因和PRV的主要毒力基因，即标志性疫苗缺失的gE基因核酸序列设计引物，以含有gE基因的重组质粒ppgE作外部参照，建立了gB和gESYBR Green PCR方法，研究了该方法的灵敏度、特异性以及重复性，现将结果报告如下。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据已经发表的伪狂犬病病毒（PRV）Rice株的gE基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号肽以外的全部编码区段,并克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌XL1-blue菌株,重组质粒pMD18-T-FL经酶切和PCR鉴定证实后,进行了序列测定。结果表明,重组质粒pMD18-T-FL含有PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号除信号肽以外的全部编码区段,长1674bp。序列比较分析表明,此区段与PRV Rice株相应区段的核苷酸序列同源性为97．5％,氨基酸序列同源性为94．8％。     

利用CRISPR/Cas9技术构建PRVGD株gI和gE缺失毒株及其生物学特性研究

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对本实验室分离得到的PRV GD株的gI和gE基因进行基因敲除,经蚀斑纯化结合PCR鉴定的方法获得gI和gE基因缺失毒株,命名为PRV GD-delgI/gE。试验测定了该基因缺失病毒在PK-15细胞中培养的一步生长曲线及其对小鼠的致病力。试验结果表明,与亲本毒株PRV GD株相比,PRV GD-delgI/gE在PK-15细胞中的繁殖能力有轻微降低,对小鼠的毒力明显降低,且该基因缺失病毒遗传稳定,可作为新型PRV疫苗的候选毒株,并为针对变异毒株的控制和新型疫苗的研制奠定了一定的基础。     

猪伪狂犬病病毒粤A株gE基因的克隆与鉴定

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株进行了PCR扩增,PCR产物克隆到pMD18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实已克隆到PRV粤A株的gE全基因。     

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E基因的序列结构分析

对猪伪狂犬病毒鲁A株(PRVLA株)gE基因进行了克隆和序列测定。应用DNAStar程序分析了PRV国内外各分离株以及PRV与HSV-1、BHV-1、EHV-1、CHV-1、MDV-1、SHV-SA8、SVV、ILTV的gE基因。PRV各分离株的gE基因有很高的同源性。不同疱疹病毒的gE核苷酸和氨基酸的同源性很低,但具有相似的结构。对上述α疱疹病毒的gE氨基酸序列进化树分析可以将其分为四个特定的组:单纯疱疹病毒组,水痘疱疹病毒组,类马立克氏病病毒组,传染性喉气管炎病毒组,推测α疱疹病毒的gE基因在进化上可能起源于ILTV的gE基因的或其前体基因。而且gE基因的进化趋势与其宿主的进化情况一致。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的克隆与序列测定

用PCR方法以伪狂犬病病毒闽A株的基因组DNA为模板扩增到了gE基因表位抗原决定域的编码区段。PCR产物连接到pMD18-T载体后，转化大肠杆菌XL1－blue菌株，重组质粒经测序并与GenBank中已登录的gE基因序列比较，确证含有PRV闽A株gE基因的表位抗原编码区，此区段与PRV Rice株相应区段的DNA序列同源性为97．3％，氨基酸序列同源性为94．7％。     

伪狂犬病病毒野毒感染猪场的gE抗体阳性头胎母猪生产成绩调查

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染多种野生动物及家畜引起的急性、热性的高度接触性传染病。为掌握PRV隐性感染对头胎母猪生产成绩的影响，本研究跟踪调查某一PRV野毒阳性稳定万头母猪场中野毒gE抗体阴性和阳性的头胎母猪总产仔数、健仔数、弱仔数、死胎数、木乃伊胎数、仔猪初生窝重以及断奶活仔数、断奶合格仔数、仔猪断奶重等不同生产成绩指标，探索相同饲养条件下伪狂犬病对头胎母猪各生产指标的影响。结果发现，每头PRV野毒gE抗体阴性头胎母猪每窝平均可产11.96头活仔猪，比gE抗体阳性母猪每胎次多产活仔0.63头，以及每胎次可多提供0.18头断奶活仔，每胎次多提供0.28头断奶合格仔。虽然PRV野毒gE抗体阳性母猪所产仔猪初生均重及断奶均重均高于gE抗体阴性母猪所产仔猪，但gE抗体阴性母猪所产仔猪断奶合格率高于gE抗体阳性母猪，表明其断奶活仔整齐度更高。综上，PRV野毒gE抗体阳性的头胎母猪生产成绩低于gE抗体阴性母猪，伪狂犬病的净化可为猪场带来更高的经济效益，表明伪狂犬病的净化至关重要。     

胶体金免疫层析法检测猪PRV gE抗体方法的建立及应用

利用PCR技术从猪伪狂犬病毒基因组中克隆gE抗原表位基因，并将其插入到载体pET-22b（＋）中，构建成原核表达质粒pET-22b（＋）-gE，使其在E．cobBL21（DE3）中诱导表达，经瘫点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物纯化后作为抗原，结合胶体佥标记技术，运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪PRV gE抗体检测的免疫层析试纸务。该方法操作简单灵敏度高、特异性好，适合猪伪狂犬病的临床诊断。     

猪伪狂犬病病毒灭活疫苗对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株的免疫保护效果评估

为评估猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）和PRV活疫苗（Bartha-K61）,免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28天采血测定PRV gB抗体,并分别使用PRV流行毒株HN1201株和经典毒株闽A株测定免疫后第0、7、14、21和28天血清的中和抗体水平,于免疫后第28天分别使用HN1201株和闽A株攻毒并观察,之后测定体温,测定攻毒后第7和14天PRV gE抗体,及攻毒后0~8 d的排毒情况。结果显示,HN1201-ΔgE免疫组较Bartha-K61免疫组gB抗体和中和抗体产生早,且抗体水平较高。两个免疫组试验猪在攻毒后虽然均无明显临床症状,且免疫组织化学检测（IHC）组织中的病毒抗原均为阴性,但HN1201-ΔgE免疫组试验猪脏器未见任何病理损伤,Bartha-K61免疫组试验猪部分脏器具有病理损伤。与未免疫对照组相比,2个免疫组试验猪在HN1201株和闽A株攻毒后,gE抗体转阳时间晚且排毒率低,HN1201-ΔgE免疫组gE抗体水平整体均低于Bartha-K61免疫组,攻毒后排毒检测中,Bartha-K61免疫组于2个毒株攻毒后第3~5天可检测到排毒,而HN1201-ΔgE免疫组全程未检测到排毒。研究结果表明,灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）对PRV流行毒株和经典毒株均可提供完全保护。     

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（porcine pesudorabies virus,PRV）gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%~100.0%和97.5%~99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%~100.0%和95.3%~99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。     

利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株

通过对4株伪狂犬病病毒(PRV)流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP~+,然后利用环化重组酶(Cre)去除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10~(3.8 )TCID_(50)和10~(2.5 )TCID_(50),表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD_(50)和10LD_(50)强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。     

伪狂犬病病毒Min-A株糖蛋白gE基因真核表达质粒的构建

根据已发表的PRV－Rice株的gE基因序列设计了一对引物,以PRV－MinA株的DNA为模板,用PCR法特异性地扩增出了PRV Min-A株的gE基因,并克隆到pUC19中,再与杆状病毒转座质粒pFastBacl连接得到pFastBac-gE,pFastBac-gE转化穿梭载体Bacmid,得到了重组rBacmid-gE表达载体。