大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达及活性研究

利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33．0Ku和13．0Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Westernblot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13．0Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素（cT）抗体发生免疫学反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,TJTG192蛋白毒性相对较大。     

大肠杆力不耐热肠毒素突变体LTR72基因的克隆及序列分析

利用PCR和点突变PCR技术，制备了大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）突变体LTR72和LT的基因片段，经酶切连接后构建了突变体重组质粒pLTR72，经酶切和序列测定证明重组子构建正确，目的突变点第72位的丙氨酸密码子已被突变成为精氨酸密码子。同时，试验构建了可以表达天然LT的表达质粒pLT作对照，二级结构分析表明，LTR72及LT之间没有显著差异。     

大肠埃希菌不耐热肠毒素研究进展

大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)是产毒性大肠埃希菌产生的一种能导致人畜腹泻的毒素,由六聚体蛋白形成AB5型结构.A亚基具有ADP核糖基转移酶活性,而B亚基为五聚体,主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合.LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性.为了将其毒性与佐剂活性分开,研究者构建了一系列无毒或减毒的突变体.证明突变体具有佐剂活性,并发现没有毒性的AB复合物以及酶活性在佐剂活性中发挥的作用是分开的.野生型LT、LT突变体以及B亚基与外源抗原共同免疫机体后,对机体免疫系统具有调节作用.     

鸡毒支原体黏附因子MGC2的克隆及原核表达

为表达鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)黏附基因MGC2蛋白,探索其作为诊断抗原的可能性,参考Gen Bank登录的鸡毒支原体F株MGC2基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对鸡毒支原体MGC2基因的1个位点进行定点突变,将此突变基因克隆到表达载体p ET-30a(+)中,具有正确阅读框架的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,PCR扩增的目的基因大小约为918 bp;SDS-PAGE检测重组蛋白相对分子质量约为39.6 ku;Western blot检测表明重组蛋白具有鸡毒支原体反应原性。该研究结果为鸡毒支原体抗体ELISA检测方法的建立奠定基础。     

产不耐热肠毒素大肠杆菌减毒突变菌株的毒性和免疫应答评价

为探究表达不耐热肠毒素突变体(mLT)的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)突变菌株黏膜免疫原性以及作为口服疫苗的应用前景,本研究采用细菌平板计数法、电镜观察和药物敏感试验检测了已构建的mLT突变菌株在LB液体培养基和人工胃肠环境下的生长曲线、菌毛生长和对抗生素的耐药性能,结果显示E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R和E.coli mLT-R192G3突变菌株的生长曲线、菌毛生长和耐药性与亲本菌株基本一致;经PCR和细菌黏附性试验检测,3株菌的突变基因遗传稳定,并且具有和亲本菌株相当的黏附能力;采用家兔肠袢结扎试验和鼠肾上腺皮质细胞(Y1)毒性试验对突变菌株产生的mLT的毒性进行检测,结果显示,3株突变菌株所产生的mLT均具有体内肠毒性,E.coli mLT-S63K产生的mLT对Y1细胞的毒性最弱,为10~(3.476) TCID_(50)/0.1 mL,是亲本菌株E.coli C83903 LT毒性(10~(7.614)TCID_(50)/0.1 mL)的1/10 000;小鼠口服突变菌后,观察小鼠临床表现,采用ELISA和中和试验检测小鼠产生的特异性抗体及其中和活性,采用MTT法测定淋巴细胞的增殖情况,结果显示,口服突变菌株对小鼠安全,能够诱导小鼠产生局部黏膜免疫应答、体液免疫应答以及细胞免疫应答,小鼠产生特异性的IgG和sIgA且对LT均具有中和活性。3株突变菌株均具有良好的免疫原性,其中E.coli mLT-S63K所产生的mLT毒性更弱,且黏膜免疫效果更好,可作为ETEC 口服疫苗的候选菌株。本研究通过减毒突变构建了表达mLT的ETEC突变菌株,并筛选出毒性弱,免疫原性好,遗传稳定的ETEC 口服疫苗候选菌株,为仔猪大肠杆菌性腹泻新型疫苗的研究提供了实验数据。     

含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

为研究分析重组大肠杆菌不耐热肠毒素（labile enterotoxin,LT）作为粘膜佐剂,配伍鸡新城疫疫苗的冻干样品对免疫鸡非特异性免疫应答的影响,在前期已经构建的LTR72/G192基础上,选择2、4μg LTRG蛋白作为每羽份疫苗添加量,及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）50%抗原量等配伍条件。按照生产条件制备冻干疫苗,进行雏鸡免疫试验,免疫后24、48、72 h采集脾脏、胸腺淋巴结,检测几种非特异性细胞因子表达水平。结果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24h即升高,48 h达最高值;添加2、4μg LTRG蛋白的NDV疫苗组IFN-β、TNF-α水平在48 h左右显著升高,其中含4μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义（P〈0.01）;IL-6、IFN-γ转录水平有所增强,但各组间差异不具有显著统计学意义（P〉0.05）,72 h左右几种细胞因子水平均迅速下降,与NDV疫苗接种组相近。由此可见,LTRG能辅助抗原诱导免疫雏鸡的非特异性免疫应答,有利于对感染病毒的清除。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。     

鸡IL-2和新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的融合表达

为进一步研究IL-2对疫苗的免疫增强作用,本研究经PCR扩增分别获得鸡IL-2和新城疫病毒(NDV)HN基因片段,应用分子克隆技术获得含有融合基因IL2-HN的真核表达载体pPICZαA-IL2-HN,重组质粒pPICZαA-IL2-HN线性化后整合入毕赤酵母X-33染色体上,在甲醇诱导下表达融合蛋白,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。SDS-PAGE分析结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为100 ku,Western-blot结果表明目的蛋白具良好的免疫反应性。     

山羊痘病毒糖蛋白基因ORF112的原核表达及多克隆抗体的制备

为探索山羊痘病毒(GTPV)糖蛋白基因ORF112在疫苗和诊断中的应用,应用PCR技术扩增GTPV弱毒疫苗株AV 41ORF112基因,将其克隆到pET-32a载体,转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后获得与预期大小相符的约37ku的融合蛋白,为可溶性和包涵体表达。应用镍离子亲和树脂对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,然后用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。免疫荧光试验表明该多克隆抗体可以与GTPV反应,为GTPV新型疫苗和诊断试剂的研究奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTR72的表达与鉴定

将重组质粒PLTR72和PLT分别转化大肠杆菌JM101，DH5α和C600，并接种于LB和CAYE-2中培养，用GM1-ELISA法检测菌体裂解液中2者的表达情况，将表达产物纯化后用SDS-PAGE等方法鉴定。结果表明，3种大肠杆菌在2种培养基中都可表达出LT突变体和LT，并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中，成为具有GM1结合活性的突变体蛋白，鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型LT相同。均是1A：5B。