用发酵罐制备嗜水气单胞菌疫苗用菌液培养条件的优化

本试验探讨了用发酵罐培养嗜水气单胞菌灭活疫苗生产菌株Ｊ－１株菌液的最佳条件。分别以发酵罐和摇床在不同的培养条件下培养Ｊ－１株制备菌液,前者１２个批次,后者６个批次。比较不同的培养条件对细菌菌体数量及ＨＥＣ毒素产量的影响。结果表明：发酵罐培养优于摇床培养,以产毒素培养基于２８℃发酵罐通气培养Ｊ－１株,培养２８小时效果最佳,培养菌液含菌量达２．９×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ,培养液上清的溶血价达２７,发酵液中残糖为０．１２ｇ／Ｌ,符合发酵工艺要求。     

嗜水气单胞菌亚单位疫苗的研制

首先提纯嗜水气单胞菌Ｊ－１株的外毒素一ＨＥＣ毒素和脂多糖，进而将脂多糖脱去类脂Ａ，再用ＥＤＣ法将ＨＥＣ毒素与多糖偶联。偶联物经双抗体夹心ＥＬＩＳＡ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析鉴定确认，ＨＥＣ毒素与多糖的偶联比为１：１．３。偶联物作为亚单位苗，对小鼠和鲫鱼均无毒性，能诱导免疫小鼠和鲫鱼产生坚强的保护，对同源菌株的攻击保护率，小鼠１００％，鲫鱼８３％。与嗜水气单胞菌的全菌苗和毒素苗相比，亚单位苗诱导的抗体出现早，滴度高，持续时间长。     

嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌亚单位二联疫苗对小鼠的免疫效果

将嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株的ＨＥＣ毒素和胞外蛋白酶（ＥＣＰ）分别与迟缓爱德华氏菌（Ｅｔ）３８株的脂多糖（ＬＰＳ）及脱毒多糖（ＰＳ）偶联,制成３种亚单位二联疫苗;ＨＥＣ－ＰＳ、ＨＥＣ－ＬＰＳ。将它们与ＡｈＪ－１和Ｅｔ３８全菌灭活疫苗一同分别免疫小鼠,并设注射ＰＢＳ对照组,检测各组小鼠体液免疫及细胞免疫水平。结果显示,用间接ＥＬＩＳＡ、溶血抑制和全菌凝集试验检出这３种亚单位疫苗的抗体水平无明显差异     

罗非鱼出血病病原鉴定及疫苗的研究

从患出血病罗非鱼的血液、肝、脾分离出嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）,经动物回归和理化试验鉴定,确诊嗜水气单胞菌为罗非鱼出血病病原;用分离菌制成的饵料吸附型疫苗进行田间试验,免疫组罗非鱼保护率为８７．１％,未免疫组存活率为５９．９％,两组间差异极显著（Ｐ〈０．０１）。     

改良DHL培养基分离嗜温有动力气单胞菌的实验研究与评价

嗜温有动力气单胞菌是指嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、豚鼠气单胞菌（Ａ．ｃａｖｉａｅ）和温和气单胞菌（Ａ．ｓｏｂｒｉａ），后两种的性状与嗜水气单胞菌基本相同。该菌对水产养殖业的危害主要是引起各种鱼类及鳖等的败血症，给水产养殖业带...     

罗非鱼出血病病原鉴定及疫苗

从惠出血病罗非鱼血液、肝脏、脾脏中分离到一株细菌,经理化鉴定,该菌为嗜水气单胞菌,动物回归试验阳性,认为该罗非鱼出血病是嗜水气单胞菌引起。用该分离菌制成的饵料及附型疫苗田间免疫罗非鱼成活率达87．1％,未免疫组成活率仅59．9％。     

甲鱼暴发性传染病的病原分离及治疗试验

从１５例表现为“红底板”、“红脖子”、“烂甲”的患病甲鱼肝脏分离到９株无荚膜、无芽胞、革兰氏阴性、β溶血的短杆菌,经理化特性鉴定均为气单胞菌属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）嗜温有动力菌群,其中温和气单胞菌（Ａ．ｓｏｂｒｉａ）７株,豚鼠气单胞菌（Ａ．ｃａｖｉａｅ）２株。从Ａ．ｓｏｂｒｉａ和Ａ．ｃａｖｉａｅ各选一代表菌株（ＪＡ－１和ＪＡ－２）分别感染健康鲫鱼均引起发病和死亡,其ＬＤ５０分别为４．３×１０５、５．５×１０７,并回收到该２种菌。在该２种菌培养上清中存在１种具有溶血活性的毒素。以ＪＡ－１和ＪＡ－２为菌种制成混合菌苗,在应用由黄芪、有机锗制成的免疫增效剂后,再用混合菌苗免疫家兔,制得的多价高免血清（效价达１∶５１２）与庆大霉素、恩诺沙星进行了治疗对比试验。结果,高免血清治疗自然病甲鱼１０９只,全部治愈;庆大霉素、恩诺沙星分别治疗自然病甲鱼７２只和８４只,平均治愈率分别为８８％和８４％。     

蒲公英内生真菌对2种鱼类病原菌抑菌效果研究

试验旨在研究蒲公英内生菌对由嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌引起鱼类疾病的作用效果,分为2部分:体外抑菌试验和攻毒试验.试验所用的嗜水气单胞菌菌液质量浓度为890万CFU/mL,迟缓爱德华氏菌菌液质量浓度为780万CFU/mL.体外抑菌试验结果显示,蒲公英内生菌对体外培养的2种细菌均有显著抑制效果,嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为24.50 mm,对迟缓爱德华氏菌的抑菌圈直径为30.53 mm.攻毒试验以黄河鲤鱼为试验鱼,注射量为0.2 mL/尾.攻毒试验设5个处理组,即对照组、注射嗜水气单胞菌攻毒组、嗜水气单胞菌攻毒后投喂蒲公英内生菌饲料组、迟缓爱德华氏菌攻毒组和迟缓爱德华氏菌攻毒后投喂蒲公英内生菌饲料组.攻毒试验显示,迟缓爱德华氏菌攻毒后投喂含有蒲公英内生菌饲料组累积病死率显著高于未注射致病菌的对照组,低于注射致病菌投喂普通饲料的试验组.嗜水气单胞菌攻毒组与嗜水气单胞菌攻毒后投喂蒲公英内生菌饲料组试验鱼累计病死率无显著性差异.     

嗜水气单胞菌疫苗的研制

取致病性嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株接种改良肉汤，摇床培养１８０ｒｐｍ２８℃２４ｈ，用福尔马林灭活制得全菌苗。另将上述培养物离心，取上清经福尔马林灭活制得毒素苗。用全菌苗和毒素苗分别免疫小鼠，２周后强化免疫，而后用Ｊ－１株５０ＬＤ＿（５０）腹腔注射攻击，免疫组均保护，对照组全部死亡。在鲫鱼的免疫保护试验中，分别采用全菌苗及毒素亩作腹腔注射或浸泡免疫，４周后强化免疫。用ＡｈＪ－１株５０ＬＤ＿（５０）腹腔注射攻击。结果全菌苗注射组保护８７％（１３／１５）；毒素苗注射组保护４０％（８、２０）；全菌苗浸泡组保护４０％（６／１５）；毒素苗浸泡组保护６７％（１０／１５）；对照组全部死亡。免疫持续期试验表明，在两次免疫６个月后攻击，全菌苗或毒素苗均仍显示一定的保护力。在平均水温２７℃±２℃下，鲫鱼的抗体动态为：全菌苗注射免疫组在强化免疫后１周全菌凝集抗体达２￣６，此时可检测到鲫鱼体表粘液中有低滴度凝集抗体存在，较高滴度的血清凝集抗体至少可维持６个月。全菌苗浸泡组在强化免疫后约１０天血清中才出现凝集抗体，滴度较低。毒素苗注射免疫用的毒素溶血抑制抗体在初次免疫第２８天达２￣７，强化免疫后高滴度抗体可维持１７天；毒素苗浸泡组的?     

天然植物复合提取物对罗非鱼的影响

为研究在饲料中添加天然植物复合提取物对罗非鱼感染嗜水气单胞菌后成活率及头肾组织酶活力的影响，试验设计了5个天然植物复合提取物浓度梯度的等氮等能饲料。饲料中天然植物复合提取物的添加量分别为0、0．05％、0．10％、0．15％和0．20％，饲喂8周后，每组取15尾鱼注射嗜水气单胞菌液。试验结果表明，饲料中添加天然植物复合提取物有助于提高感染嗜水气单胞菌后罗非鱼的成活率，并能显著提高头肾溶菌酶、超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶的活力。以感染嗜水气单胞菌后的成活率和头肾组织酶活力为指标，罗非鱼饲料中天然植物复合提取物的适宜添加量为0．10％～0．15％。     

6株嗜水气单胞菌的毒力因子及其对小鼠的致死性

根据嗜水气单胞菌毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白３种毒力因子的检测结果,从６６株嗜水气单胞菌中选出３种毒力因子分布情况各异的有代表性的６个菌株。分别用含菌量均为１０８ＣＦＵ／ｍＬ的６株嗜水气单胞菌肉汤培养物注射小鼠,结果,毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白均有的菌株以及具有前两者而无Ｓ蛋白的菌株对小鼠的致死率均达１００％;仅有蛋白酶的菌株对小鼠致死率达６０％;而只有Ｓ蛋白的,或既有毒素又有Ｓ蛋白的,或３种毒力因子均无的菌株对小鼠无致死性。     

嗜水气单胞菌选择培养基鉴别效果的比较

本试验比较了嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ,Ａｈ）三种选择培养基ＡＨＭ、ＡＰＭ和ＲＳ培养基的鉴别效果,并用于１２１株细菌检测,Ａｈ的阳性检出率分别是５４．７６％、８１．３３％和８３．５４％。经过交叉比较分析,确定ＡＨＭ和ＲＳ可作为适用于生产实践的Ａｈ的选择培养基。     

草鱼肠炎的病原菌检验与分析

对２个鱼场的５尾病鱼的肠内容物及肝进行细菌学检查,在其中２尾病死鱼及１尾病鱼的肝中发现形态特征一致的细菌并分别到菌落特征基本一致的细菌在５尾鱼的肠内容物中均发现并分离到几乎纯一的肝中相同的细菌经对２４纯培养菌理化特性鉴定,初步表明分离菌为气单胞菌属的哮敢单胞菌、温和气单胞菌及豚敢单胞菌,其中以嗜水气单胞菌占优势。回归试验表明,分离鉴定的３种气单胞菌均有致病性。     

鱼嗜水气单胞菌疫苗研究进展

嗜水气单胞菌是一种人兽共患的致病菌,对水产养殖造成巨大危害。己报道的嗜水气单胞菌疫苗有全菌灭活苗、菌体成分亚单位疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗,现分别综述。     

致病性嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物菌株的分离鉴定

对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行了细菌分离鉴定，共检出46株嗜水气单胞菌疑似菌，通过生化试验结合PCR扩增气溶素基因Aer，确定其中22株为致病性嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性，其中有4株对喹诺酮类药物耐药，并且为交叉耐药，耐药菌检出率为18．2％，纸片扩散法检测其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌负染后电镜观察，耐药菌表面有许多大小不同的球形结构，而敏感菌表面则为细丝状菌毛结构。     

应用间接荧光抗体法检测鱼类嗜水气单胞菌的试验研究

作者制备了鱼类嗜水气单胞菌（AH）－77株兔抗血清,建立了应用间接荧光抗体试验（IFA）检测鱼类嗜水气单胞菌病原的方法。该法能有效地检测人工感染鳟鱼体内的嗜水气单胞菌病原体,对杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌、爱德华氏菌不发生交叉反应。整个过程可在2．5h内完成,是一种有前途的鱼类嗜水气单胞菌快速诊断方法。     

解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其对嗜水气单胞菌抑制作用研究

本试验从鲫鱼肠道中分离到1株芽孢杆菌,经生物学特性测定及16S rRNA测序分析,鉴定该分离菌株为高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌(命名为JX001).对该分离菌进行嗜水气单胞菌体外抑菌试验,结果发现有明显的抑菌圈和抑菌带,说明该分离菌对嗜水气单胞菌具有较强的抑制作用,在养殖水中加入分离菌JX001可防止嗜水气单胞菌的暴发;同时分离菌JX001在生长代谢过程中产生大量的蛋白酶,可有效地促进蛋白质水解,用于蛋白质饲料的降解.     

环介导等温扩增联合横向侧流试纸(LAMP-LFD)对嗜水气单胞菌快速检测方法的建立

以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因为检测靶标,设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记探针,建立了嗜水气单胞菌的LAMP-LFD快速检测方法。该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成检测。经优化,LAMP最佳反应条件为63℃,反应30min,从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40min,比常规PCR检测缩短近2h。试验结果表明,LAMP-LFD可特异性检出嗜水气单胞菌,对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性;其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2.03×101 CFU/mL或0.81CFU/反应,是常规PCR(以F3/B3为引物)的100倍;可从人工污染1×102 CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌。嗜水气单胞菌(106 CFU)人工感染鲫鱼24h,传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1.2×105 CFU/g和6×103 CFU/g;利用LAMP-LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原;以F3/B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌,表明面对实际感染样品,LAMP-LFD的检测灵敏度优于PCR方法。因此,该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段。     

抗嗜水气单胞菌大黄内生真菌的分离鉴定和初步应用

为从大黄根部分离出对嗜水气单胞菌具有抗性的内生真菌,用75%乙醇和0.1%升汞组合对大黄根部进行表面消毒后,分离并纯化获得大黄内生真菌。以嗜水气单胞菌为指示菌做抑菌试验,筛选出抗嗜水气单胞菌的大黄内生真菌。试验结果:从大黄根部组织共获得28株大黄内生真菌,筛选出4株对嗜水气单胞菌有抑制效果的大黄内生真菌,经形态学初步鉴定3株属于链格孢霉属,1株属于半知菌属,体内攻毒试验证实:9号内生真菌发酵液能提高试验鱼的成活率,通过提高酸性磷酸酶水平达到保护试验鱼抵抗嗜水气单胞菌攻击的作用。     

市售淡水鱼肠内气单胞菌及类志贺邻单胞菌的调查

对市售的６种淡水鱼共采肠内容物样品７３份，检出气单胞菌３２株，阳性率为４３．８４％；类志贺邻单胞菌１７株，阳性率为２３．２９％。其中有８份样品同时检出上述两菌。对３２株气单胞菌用８项生化试验鉴定为４个种，分别是嗜水气单胞菌１６株，豚鼠气单胞菌８株，温和气单胞菌７株，简达气单胞菌１株。