猪瘟病毒E2基因密码子优化后在昆虫细胞中的表达

将猪瘟病毒E2基因密码子改造后,克隆入pFastBac1质粒载体,经转座、转染后构建重组杆状病毒.并对表达产物进行鉴定分析.结果:E2基因改造后与设计序列一致;成功获得了重组杆状病毒(BAC/SE2M),采用猪瘟E2单抗WH303进行Western-blot和ELISA鉴定,证明:表达的CSFV E2蛋白特异性好,纯化后的E2蛋白,可用于猪瘟抗体检测试剂盒的开发.     

信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽（简称endo）、蜂素信号肽（简称mel）及gp67信号肽（简称gp67）分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25mg·L~(-1)。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白，并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性，为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段，运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体，构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清，通过间接ELISA方法测定抗体水平，间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示，37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下，E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达，经纯化复性后免疫小鼠，制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白，制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白，制备相应的多克隆抗体，根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成，随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中，获得重组杆状病毒质粒，再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示，B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应，并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白，B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠，制备小鼠多克隆抗体，经间接ELISA检测，该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。     

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的免疫原性分析

本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株.利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5-E2.该重组病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM.对重组病毒进行western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验以及淋巴细胞增殖试验.Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组GP5和E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP5和E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组GP5和E2蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSV和抗CSFV的特异性抗体;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答.本试验成功构建表面展示PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和CSFV的混合感染奠定基础.     

猪瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位区的原核表达与蛋白纯化

为制备具有活性的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒包被抗原,本研究将猪瘟病毒E2蛋白主要抗原表位区A-D部分基因插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-E2AD,将其转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。对IPTG浓度和诱导时间进行优化,确定在37℃条件下、IPTG终浓度为0.2 mmol/L时诱导表达4 h,E2AD蛋白的表达量最高。通过对包涵体的纯化条件进行摸索,最终获得目的蛋白的浓度为0.2 g/L。Western blot分析结果显示,E2AD蛋白能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2AD蛋白具有良好的反应原性。该结果为进一步开展猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研制工作奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

本研究通过建立CSFV噬菌体展示多肽库,并对其进行生物淘选,以期获得E2蛋白上新的抗原表位.选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株,采用噬菌体展示技术,以T7select415-1b为载体,分别构建了CSFV SM株和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(SM-E2库和HCLV-E2库).通过生物淘选和噬菌体原位杂交技术,采用7株猪瘟单克隆抗体和1株猪瘟高免血清分别对构建的SM-E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛选.结果共筛选到了5条与E2蛋白高度同源的序列,在E2蛋白上的同源区域分别为TAVSPTTLR、YYEP、TTWKEYSH、GGQ(V)VK和PDGLPHY.结果表明,TAVSPTTLR、YYEP和TTWKEYSH序列与目前已知E2蛋白表位一致,说明它们是E2蛋白上的优势表位;GGQ(V)VK和PDGLPHY序列与预测表位一致,推测是E2蛋白上潜在的抗原表位.     

猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究

利用基因搭桥技术，在Klenow DNA聚合酶作用下，分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因，并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定，构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下.实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C、GSTD、GST-E)，以GST亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。应用ELISA和Western-blot检测证实：E抗原表位基因表达的融合蛋白GST-E具有免疫学活性，而C和D的抗原表位基因虽然都表达了融合蛋白GST-C和GSTD，但未检测到免疫学活性。免疫攻毒保护试验表明：融合蛋白GST-E具有一定的免疫保护功能，为多表位疫苗的研究奠定了基础。     

猪霍乱沙门菌C500运载猪瘟病毒新型基因疫苗在家兔体内的免疫应答

为研究猪霍乱沙门菌C500(S.C500)运载猪瘟病毒(CSFV)新型基因疫苗口服免疫家兔的体内免疫应答特点,采用电转化法将CSFV新型基因疫苗转化到S.C500,构建重组工程菌,口服免疫接种家兔,检测CSFV、S.C500特异性抗体;并用猪瘟兔化弱毒疫苗及猪伤寒沙门菌野毒株依次进行攻毒试验。结果显示,成功构建CSFV新型基因疫苗重组菌S.C500/pCB-ME2-IL-15,S.C500/pCC-ME2-IL-15。口服免疫家兔可以诱导产生抗CSFV和S.C500的特异性ELISA抗体,且S.C500/pCC-ME2-IL-15略显优势。经三免后免疫家兔能够部分抵抗猪瘟兔化弱毒疫苗与猪伤寒沙门菌野毒株的攻击。试验提示以S.C500为CSFV新型基因疫苗运载体的猪用重组活菌苗具有可行性。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

绿色荧光蛋白基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株E2基因在杆状病毒中的融合表达

为了研究猪瘟病毒E2糖蛋白的立体结构及生物学特性，将增强型荧光蛋白基因（EGFP）和猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCI.V）E2基因经PCR扩增后克隆至pBlueBacHis2A质粒，与杆状病毒DNA共转染后经PCR鉴定获得了含有EGFP和HCLVE2融合基因（GFPTE2）的重组杆状病毒rBACTE2-339，并将其感染sf9细胞后在荧光显微镜下观察到了亮绿色荧光．说明融合基因已初步表达。     

Efficacy of a live attenuated vaccine in classical swine fever virus postnatally persistently infected pigs

Classical swine fever (CSF) causes major losses in pig farming, with various degrees of disease severity. Efficient live attenuated vaccines against classical swine fever virus (CSFV) are used routinely in endemic countries. However, despite intensive vaccination programs in these areas for more than 20 years, CSF has not been eradicated. Molecular epidemiology studies in these regions suggests that the virus circulating in the field has evolved under the positive selection pressure exerted by the immune response to the vaccine, leading to new attenuated viral variants. Recent work by our group demonstrated that a high proportion of persistently infected piglets can be generated by early postnatal infection with low and moderately virulent CSFV strains. Here, we studied the immune response to a hog cholera lapinised virus vaccine (HCLV), C-strain, in six-week-old persistently infected pigs following post-natal infection. CSFV-negative pigs were vaccinated as controls. The humoral and interferon gamma responses as well as the CSFV RNA loads were monitored for 21 days post-vaccination. No vaccine viral RNA was detected in the serum samples and tonsils from CSFV postnatally persistently infected pigs for 21 days post-vaccination. Furthermore, no E2-specific antibody response or neutralising antibody titres were shown in CSFV persistently infected vaccinated animals. Likewise, no of IFN-gamma producing cell response against CSFV or PHA was observed. To our knowledge, this is the first report demonstrating the absence of a response to vaccination in CSFV persistently infected pigs.     

Development of a triplex TaqMan real-time RT-PCR assay for differential detection of wild-type and HCLV vaccine strains of classical swine fever virus and bovine viral diarrhea virus 1

In this study, genomic sequences of pestiviruses available in GenBank were aligned to design three primer pairs and TaqMan probes: two targeting the NS5A region of the viral genome of classical swine fever virus (CSFV) for the differentiation of wild-type CSFV and hog cholera lapinized vaccine (HCLV) vaccine, and one targeting the 5'-untranslated region of bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1). With these primers and probes, a triplex TaqMan real-time RT-PCR assay was developed for differentiating wild-type CSFV, the HCLV strain, and BVDV-1. The detection limit of the assay was 4.5 TCID(50) for wild-type CSFV, 10 TCID(50) for HCLV-strain CSFV, and 3.2 TCID(50) for BVDV-1. The triplex real-time RT-PCR had at least 98% (248 samples) agreement with other RT-PCR methods. The assay provides a sensitive tool for simultaneous detection and differentiation of wild-type CSFV and HCLV from BVDV-1.     

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒（CSFV）E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R²值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。